Generierung von Konsensusklonen für die Etablierung eines Replikonsystems nach Amplifikation klinisch charakterisierter Hepatitis-C-Virus-Isolate

Das Hepatitis C Virus (HCV) ist Auslöser einer oftmals chronisch verlaufenden Leberentzündung mit einem erhöhten Risiko für die Entwicklung einer Leberzirrhose und deren Folgen. Die weltweite Prävalenz der Hepatitis C beträgt ca. 3%; allein in Deutschland treten jährlich mehr als 5000 Neuinfektionen auf. Das HCV lässt sich aufgrund phylogenetischer Untersuchungen in mindestens 6 Genotypen und jeweils mehrere Subtypen einteilen, wobei der HCV Subtyp 1b in Europa am häufigsten vorkommt. Die Hepatitis C Forschung wurde lange Zeit durch das Fehlen eines geeigneten Zellkulturmodells erschwert. Mit der Etablierung eines stabil replizierenden Zellkulturmodells in humanen Hepatomazellen 1999 durch Lohmann et al. wurden erstmals molekularbiologische Untersuchungen in grossem Umfang möglich. Die seither existierenden Zellkulturmodelle haben jedoch den Nachteil, dass nicht definiert ist, wie sich das Isolat, aus dem das Replikon geschaffen wurde, klinisch verhält. Unter einer Interferon-basierten Therapie sprechen manche Patienten mit einer dauerhaften Negativierung der HCV RNA Konzentration an (sustained responder, SR), während bei anderen sowohl während als auch nach Therapieende weiterhin HCV RNA im Blut nachweisbar ist (non-responder, NR), obwohl beide Patienten mit demselben Subtyp von HCV infiziert sind und dieselbe Therapie erhalten. Die Ursachen für dieses unterschiedliche Therapieansprechen sind basierend auf Mutationsstudien von HCV Isolaten von Patienten mit unterschiedlichem Therapieansprechen zumindest teilweise genomisch bedingt. Daher wurden in der vorliegenden Arbeit zwei Konsensusklone zur Einbringung in ein replikatives Zellkulturmodell aus HCV Subtyp 1b Isolaten geschaffen, deren klinisches Verhalten unter Therapie klar charakterisiert ist. Dazu wurde Serum von je einem Patienten herangezogen, der unter definierten Studienbedingungen als SR oder NR bekannt war. Aus den Sera wurde die Virus-RNA extrahiert und mit Hilfe eines eigens dafür entwickelten RT-PCR-Protokolls und anschließender Klonierung in E. coli vervielfältigt. Um zufällige Mutationen und seltene Quasispezies auszuschließen, wurde dann nach vollständiger Sequenzierung von jeweils vier Einzelklonen mittels gezielter Mutagenese und Umklonierung eine Konsensussequenz geschaffen, die einen Durchschnitt der am häufigsten vorkommenden Quasispezies darstellt. Diese Konsensusklone wurden in einen Vektor zur Herstellung von RNA Transkripten eingefügt, so dass die Transkripte direkt zur Einbringung als Replikons in Zellkulturen genutzt werden können. Mit diesen klinisch charakterisierten Isolaten kann nun erstmals nach Unterschieden geforscht werden, die ursächlich für Therapieerfolg oder –misserfolg sein könnten. So können eventuell neue Therapieformen gefunden oder bereits vor Beginn einer Therapie eine Aussage zur Prognose getroffen werden.Hepatitis C virus (HCV) infection is one of the major causes of chronic liver disease, leading to liver cirrhosis and its sequelae. Worldwide the prevalence of positive HCV antibodies is approximately 3%. In Germany more than 5,000 new HCV infections per year are recorded. By phylogenetic sequence analyses HCV isolates can be divided into at least six genotypes and multiple subtypes. In Europe, HCV subtype 1b is most prevalent. Molecular and pharmacological studies on hepatitis C virus have been hampered for many years due to the lack of an efficient cell culture model. In 1999 a stable replicating cell culture model based on a human hepatoma cell line was established by Lohmann et al. However, all different HCV isolates for replication in this replicating cell culture model lack information about epidemiological, virological and therapeutic features of the patients they were originally isolated from. Interferon alpha-based therapy in some patients is leading to sustained virologic response (SR) with undetectable HCV RNA at the end of treatment and during follow up, while in other patients HCV RNA remains detectable in blood during and after treatment (non responders, NR), although patients are infected with the same HCV subtype and received the identical treatment schedules. Based on mutational analyses of HCV isolates of patients with and without virologic response to interferon-based therapies these differences are at least in part explained by HCV genomic mutations. Therefore in the present study, two clinical characterized HCV subtype 1b consensus clones where produced for cell culture repli-cation. Pre-treatment serum samples of patients known as SR or NR where used to extract viral RNA for amplification by a newly established special long-RT-PCR protocol. Four single clones were respectively selected and fully sequenced. To eliminate the risk of random mutations and potentially replicational deficient isolates of HCV quasispecies, a consensus sequence was generated using site-directed mutagenesis and different cloning procedures. Consensus clones of NR and SR isolates where then introduced into a special vector for production of RNA transcripts and transfection to human hepatoma cells. With these clinical characterized HCV consensus isolates it is possible for the first time to investigate genomic differences causing treatment response or non response in vitro. On the basis of observed differences between interferon-sensitive and -resistant HCV isolates new antiviral therapies may be observed and a more refined prediction of treatment response before initiation of therapy may be possible