Characterization of heat stress transcription factors of Lycopersicon peruvianum and Arabidopsis thaliana in their function as transcriptional activators

Heat stress transcription factors (Hsfs) are the central regulatory components of a signal transduction chain mediating the activation of genes responsive to heat stress and a number of chemical stressors. Sequencing of the Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) genome revealed the existence of 21 ORFs encoding putative Hsfs. By structural characteristics and phylogenetic comparison, the 21 representatives are assigned to classes A, B and C. The major part of the thesis presents functional genomics approaches to analyze the Hsf family of Arabidopsis. To support general concepts of the activator function of plant Hsfs, representatives from Lycopersicon peruvianum (tomato) were analyzed as starting points. Similar to other proteins regulating gene activity, Hsfs have a modular structure. The 21 Arabidopsis Hsfs were analyzed in respect to functional modules important for their oligomerization state, intracellular localization as well as for their transcription activation potential. Essential for transcriptional activity of class A Hsfs are short peptide motifs enriched in aromatic and large hydrophobic amino acid residues embedded in an acidic surrounding (AHA motifs), which interact with components of the transcriptional machinery as shown by GST pull-down assays. The general concept of AHA motifs as cohesive interfaces for the interaction with the transcriptional machinery is supported by mutational analysis, which is demonstrated in most detail for LpHsfA2 and LpHsfA1 from Lycopersicon peruvianum (tomato) with reporter assays in tobacco protoplasts and yeast as well as by GST pull-down experiments. In contrast to class A Hsfs, class B and class C Hsfs lack AHA motifs and have no activator function on their own, but evidence was presented that they may act as coregulators of class A Hsfs. It was shown that this is a unique but common feature of plants. All 21 Arabidopsis Hsfs are expressed, at least on the transcript level. But the expression levels change dynamically in response to heat stress and/or developmental signals. The functional characterization of the Hsf family of Arabidopsis gave first insights into the complex network of Hsfs but demonstrated also that, compared to the simple situation in Drosophila and yeast with only one Hsf and vertebrates with three Hsfs, the complex plant Hsf system is a fine-tuned and efficient prerequisite for plants to respond rapidly and successfully to environmental changes from which they cannot escape.Hitze-Stress-Transkriptionsfaktoren (Hsfs) stellen die zentralen regulatorischen Komponenten einer Signal-Transduktionskette dar, welche die Aktivierung von Hitze-Stress-induzierbaren Genen bewirken. Die Sequenzierung des Genoms von Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) führte zu der Entdeckung von 21 Genen, die für putative Hsfs codieren. Aufgrund struktureller Charakteristika und phylogenetischer Analysen wurden die 21 Hsfs in die Klassen A, B und C aufgeteilt. Der Hauptteil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der funktionellen Charakterisierung der Hsf Familie aus Arabidopsis. Um generelle Konzepte zur Funktion von pflanzlichen Hsfs als Aktivatoren zu unterstützen, wurden als Ausgangspunkt ausgewählte Hsfs aus Lycopersicon peruvianum (Tomate) zu detaillierten Analysen herangezogen. Hsfs besitzen, ähnlich anderen Transkriptions -aktivierenden Proteinen, eine modulare Struktur. In der vorliegenden Arbeit wurden funktionelle Module der 21 Arabidopsis Hsfs untersucht, die für den Oligomerisierungs-Zustand, die intrazelluläre Lokalisation sowie das Transkriptions-aktivierende Potential von Bedeutung sind. Essentiell für die Funktion von Klasse A Hsfs als Transkriptions-Aktivatoren sind kurze Peptidmotive, die durch aromatische und große hydrophobe Aminosäure-Seitenketten geprägt sind, die in einer sauren Umgebung eingebettet sind (AHA Motive: aromatic, large hydrophobic and acid amino acid residues). Es wurde mit GST pull-down Assays gezeigt, dass AHA Motive mit ausgewählten Transkriptions-Komplexen interagieren. Das generelle Konzept für AHA Motive als kohäsive Elemente zur Interaktion mit der Transkriptions- Maschinerie wurde durch Mutationsanalysen verifiziert, besonders detailliert am Beispiel von LpHsfA2 und LpHsfA1 aus Tomate in Reporter-Assays in Tabak-Protoplasten und Hefe als auch GST pull-down Experimenten gezeigt. Im Kontrast zu den Klasse A Hsfs besitzen Klasse B und C Hsfs keine AHA Motive. Diese zeigten auch keine eigene Aktivator-Funktion aber Experimente deuten darauf hin, daß sie Coregulatoren für Klasse A Hsfs darstellen. Es wurde gezeigt, dass diese pflanzliche Besonderheit bei Tomate als auch Arabidopsis existiert. Alle 21 Arabidopsis Hsfs wurden als Transkripte nachgewiesen, ihre Expression verhält sich sehr dynamisch in bezug auf Hitze-Stress als auch Entwicklungssignale. Die präsentierte funktionelle Charakterisierung der Hsf Familie von Arabidopsis gibt erste Einsichten in das komplexe Netzwerk der Hsfs und demonstriert bereits, dass im Vergleich zu anderen Organismen, wie z.B. Drosophila und Hefe mit einem Hsf und Säugern mit drei Hsfs, das komplexe pflanzliche Hsf System eine fein regulierte und effiziente Voraussetzung für Pflanzen darstellt, um schnell und vor allem erfolgreich auf Umwelteinflüsse zu reagieren, denen sie nicht entfliehen können