Molekulare Regulation der UDP-Zucker-Biosynthese Untersuchungen anhand der myo-Inositoxygenase

Der Nukleotidzucker UDP-Glucuronsäure ist die prinzipielle Zuckervorstufe für UDP-Galacturonsäure, -Xylose, -Arabinose und –Apiose, welche alle in die Zellwandpolymere der pflanzlichen Zellwand einfließen. UDP-Glucuronsäure kann in Arabidopsis über zwei alternative, funktionelle Synthesewege gebildet werden, wobei entweder die UDP-Glucose-Dehydrogenase oder die myo-Inositoxygenase als Schlüsselenzym, welche den Kohlehydratfluss in Richtung Zellwandbiosynthese katalysiert, involviert ist. In dieser Arbeit wurden die Gene für die Enzymisoformen der Inositoxygenase (MIOX) aus Arabidopsis thaliana analysiert. Sie repräsentieren eine kleine Genfamilie bestehend aus vier Isoformen. Studien mittels Promotor::GUS-Konstrukten und RT-PCR zeigten, dass die Transkription der MIOX-Gene eine sehr transiente und organspezifische Genexpression ist. Die Isoformen MIOX1 und MIOX2 ließen sich in nahezu allen Geweben nachweisen wogegen die Isoformen MIOX4/5 nur in den generativen Geweben aufzufinden waren. Es konnte eine deutliche Präsenz aller vier MIOX-Isoformen in den generativen Geweben nachgewiesen werden und die Nukleotidzucker, die während der Samenentwicklung benötigt werden, scheinen überwiegend über die MIOX zur Verfügung gestellt zu werden. So zeigen T-DNA-Insertionslinien von ΔMIOX1 & 2 eine reduzierte Schleimhülle um die Samen und eine erhöhte Ausfallrate bei der Samenentwicklung auf. Ansonsten zeigen die untersuchten T-DNA-Insertionslinien einen ähnlichen Wuchs wie der Wildtyp auf. Auch konnten keine Unterschiede über die durchgeführten Zellwandanalysen, mittels GC-MS, MALDI und Dionex-HPLC verifiziert werden, was durch die Redundanz der MIOX- und UGD-Isoformen erklärt werden könnte. Nichtsdestotrotz konnte bei den Isoformen ΔMIOX1 & 2 eine dramatische Reduktion beim Einbau von 3H-Inosit in Zellwandpolymere von Keimlingen verzeichnet werden, was einen klaren Beweis für eine funktionelle MIOX liefert, da in diesem Gewebe diese beiden Isoformen die einzig aktiven sind. Außerdem konnten über Promotor-Deletions-Analysen potentielle cis-Elemente für die Promotoren von MIOX2 und MIOX4 aufgedeckt werden.The nucleotide sugar UDP-glucuronic acid (UDP-GlcA) is the principal precursor for UDP-galacturonic acid, -xylose, -arabinose and –apiose which are sugar residues of the plant cell wall polysaccharides. UDP-GlcA can be synthesized by two different functional pathways in Arabidopsis involving either UDP-glucose dehydrogenase or myo-inositol oxygenase as the initial key enzyme reaction to channel carbohydrates into the pool of UDP-sugars used for the cell wall biosynthesis. In this work the genes for the enzyme myo-inositol oxygenase (MIOX) were analyzed in Arabidopsis. They represent a small gene family containing four members. The transcription of all those members indicates a transient and organ-specific gene expression analyzed by promoter::GUS reporter gene lines and RT-PCR. The isoforms MIOX1 and MIOX2 are expressed in almost all tissues, whereas MIOX4/5 was largely restricted to the generative tissues like flowers and particularly maturing pollen. All MIOX-isoforms are most prominent in reproductive tissues which was shown clearly by expression analyzes. Nucleotide sugars needed during seed development seemed to be mostly synthesized by the inositol oxidation pathway. T-DNA insertion-lines were analyzed and it was shown that ΔMIOX1 & 2 had a reduced mucilage capsule around the seeds. Also these two isoforms showed an increased casualty during seed development. However, single knock-outs showed growth phenotypes similar to the wild type. Cell wall analysis via GC-MS, MALDI and Dionex-HPLC showed no significant changes compared to the wild type, which could be explained by the redundancy of the MIOX- and UGD-isoforms. However, the incorporation of 3H-inositol into wall polymers of seedlings was greatly impaired in the mutant lines ΔMIOX1 and ΔMIOX2, which are the only isoforms that are expressed in seedlings. These data provide strong evidence for a functional inositol oxidation pathway in plants involved in the biosynthesis of cell wall polysaccharides. Additionally, analyzes of promoter-deletion constructs indicated new potential cis-elements for the promoter of MIOX2 and MIOX4