Neurogenese im Hippokampus der Maus : zur Rolle von extrazellulären Nukleotiden als Signalmolekülen

Active neurogenesis continuously takes place in the dentate gyrus of the adult mammalian brain. The dentate gyrus of the adult rodent hippocampus contains an astrocytelike cell population that is regarded as residual radial glia. These cells reside with their cell bodies in the subgranular layer (SGL). Radial processes traverse the granule cell layer (GCL) and form bushy ramifications in the inner molecular layer (IML). The residual radial glial cells apparently represent neuronal progenitor cells that can give rise to functionally integrated granule cells. To date the cellular and molecular events driving a subpopulation of these cells into neurogenesis as well as the cellular transition states are poorly understood. The present study shows, that in the mouse dentate gyrus, this cell type selectively expresses surfacelocated ATPhydrolyzing activity and is immunopositive for nucleoside triphosphate diphosphohydrolase 2 (NTPDase2). NTPDase2 is an ectoenzyme and hydrolyzes extracellular nucleoside triphosphates such as ATP or UTP to their respective nucleoside diphosphates. The enzyme becomes expressed in the hippocampus during late embryogenesis from E17 onwards, and is thus not involved in early brain development. Its embryonicpattern of expression mirrors dentate migration of neuroblasts and the formation of the primary and finally the tertiary dentate matrix. NTPDase2 is also expressed by a transient population of cortical radial glia from late embryonic development until postnatal day 5. NTPDase2 can be employed as a novel markerfor defining cellular transition states along the neurogenic pathway. It is associated with subpopulations of GFAP and nestinpositive cells. These intermediate filaments are typically expressed by the progenitor cells of the dentate gyrus. In addition there is a considerable overlap with doublecortinand PSANCAM positive cells. The expression of the microtubuleassociated protein doublecortin and of PSANCAM which are expressed by migrating neuroblasts is indicative of a transition of progenitors to a neural phenotype or an immature form of granule cell. NTPDase2 is no longer associated with young neurons and with maturegranule cells, as indicated by the lack of doubleimmunostaining for III tubulin and NeuN, respectively. Furthermore, β S100positive astrocytes do not express NTPDase2 validating that NTPDase2 is also not associated with later stages of gliogenesis. Experiments with the Sphase marker bromodeoxyuridine (BrdU) demonstrate that NTPDase2positive cell proliferate. Postmitotic BrdU-labeled cells preferentially acquire an NTPDase2positive phenotype. Many of these cells were also positive for GFAP. The contribution of BrdUlabeled cells positive for NTPDase2 increased with time from 2 h to 72 h, validating a strong association of NTPDase2 with proliferating cells of the dentate gyrus. The colocalization studies with various markers and the results of the experiments suggestthat NTPDase2 is associated with cell types of varying maturation states but not with mature neurons or astrocytes. Studies on the formation of neurospheres from the dentate gyrus validate previous data suggesting that the hippocampal progenitors have little capacity for self renewal in vitro. In situ hybridization results indicate the presence of one of the metabotropic purinergic receptor subtypes (the P2Y1 receptor) within the adult neurogenic regions, the dentate gyrus and the lateral walls of the lateral ventricles. A patchclamp analysis demonstrates the presence of functional ionotropic nucleotide receptor (P2X receptors) in progenitor cells expressing nestin promotordriven GFP. They suggest that the signaling pathway via extracellular nucleotides and nucleotide receptors may play a role in the control of adult hippocampal neurogenesis.Eine Neubildung von Nervenzellen (Neurogenese) findet auch noch im adulten Nagerhirn statt und zwar in zwei begrenzten Hirngebieten, der subventrikulären Zone der Seitenventrikel (SVZ) und im Gyrus dentatus des Hippokampus. Der Gyrus dentatus enthält eine Population Astrozytenähnlicher Zellen, die als Residuum der Radialglia betrachtet werden. Die Zellkörper dieser stark polaren Zellen liegen in der subgranulären Schicht (SGL). Radiale Fortsätze dieser Zellen verlaufen durch die Körnerzellschicht (GCL) und bilden in der inneren Molekularschicht buschige Verzweigungen. Zahlreiche Befunde sprechen dafür, dass diese Residualglia neuronale Vorläuferzellen darstellt, welche letztlich funktionell integrierte Körnerzellen bilden können. Gegenwärtig wenig verstanden sich die zellulären und molekularen Steuermechanismen, die eine Subpopulation dieser Zellen zum Eintritt in die Neurogenese veranlassen sowie auch die einzelnen zellulären Übergangsstadien, die schließlich zu Ausbildung der reifen Neuronen führen. In früheren Untersuchungen aus diesem Labor war mittels Enzymhistochemie, Immunhistochemie und im Western-Blot gezeigt worden, dass das Enzym Ekto-Nukleosidtriphosphat-Diphosphohydrolase2 (NTPDase2) selektiv von den Stammzellen der SVZ exprimiert wird. NTPDase2 ist ein integrales Portein der Plasmamembran, dessen katalytisches Zentrum in den extrazellulären Raum weist. Es hydrolysiert extrazelluläre Nukleosidtriphosphate wie ATP und UTP zu den entsprechenden Nukleosiddiphosphaten. Die Untersuchungen legten nahe, das der Signalweg über extrezelluläre Purine eine Rolle bei der Kontrolle der adulten Neurogenese spielt. Daher wurde zunächst untersucht, ob die NTPDase 2 auch auf Vorläuferzellen des Hippocampus exprimiert wird, um gegebenenfalls dann ihre zelluläre Lokalisierung auf zellulären Übergangsformen des neurogenetischen Weges genauer zu charakterisieren. Die vorgelegten Untersuchungen zeigen, dass die residuale Radialglia im Gyrus dentatus der Maus die NTPDase2 exprimiert. Mittels Enzymhistochemie konnte im Gyrus dentatus von WildtypMäusen (CBbl/6J) eine kräftige ATPaseAktivität nachgewiesen werden. Die Zellkörper der markierten Zellen lagen in der SGL. Allerdings waren die einzelnen Zellen wegen der starken Präzipitatbildung nicht einfach zu identifizieren. Dagegen konnte die Ausbildung der markierten radialen Fortsätze in der Körnerzellschicht und die buschigen Verzeigungen in der inneren Molekularschicht klar identifiziert werden. Ein praktisch identisches Bild wurde mittel Immunfärbung hippokampaler Schnitte mit einem NTPDase2-spezifischen Antikörper erhalten. Die Markierung war in der SGL am intensivsten, in der zahlreiche kleine radiale Zellfortsätze ein dichtes Maschenwerk bildeten. Ebenso waren deutlich die radialen Fortsätze und deren terminale Verzweigungen markiert. Die Expression der NTPDase2 im Hippocampus wurde im Western-Blot zusätzlich bestätigt. Es zeigte sich ein kräftiges Proteinband von 70 kDa in Proteinfraktionen aus dem Gesamthippokampus sowie einer daraus gewonnen Membranfraktion. Die Expression des Enzyms beginnt in der späten Embryonalentwicklung ab E17. Demnach ist die NTPDase2 nicht in die frühe Hirnentwicklung involviert. Das embryonale Expressionsmuster spiegelt die Wanderung der Neuroblasten in die Anlage des Gyrus dentatus wieder sowie die Ausbildung einer primären und schließlich tertiären Matrix. Die immunmarkierten Zellen der sekundären Matrix bildeten ein Cförmige Struktur, die ab den postnatalen Tagen P1 und P3 deutlich zu identifizieren war. Der radiäre Gliatyp mit den Zellkörpern an der inneren Oberfläche der Körnerzellschicht bildete sich erstmals an P5 aus. Ab P23 entsprach das Bild der Immunmarkierung dem adulter Tiere. Dieses Markierungsmuster war auch noch bei sehr alten Tieren erhalten aber die Immunmarkierung nahm ab dem Adultstadium mit zunehmenden Alter ab. Die Markierungsstudien an unterschiedlichen Entwicklungsstadien legen nahe, dass die NTPDase2 selektiv mit Vorläuferzellen des Gyrus dentatus assoziiert ist, beginnend mit der frühen Wanderung von Vorläuferzellen in die Anlage des Gyrus dentatus währen der Embryonalentwicklung. Eine kräftige Immunmarkierung wurde auch in der Radialglia des frühen postnatalen Kortex gefunden. Diese Markierung findet sich allerdings nicht in der embryonal ausgebildeten Radialglia. Die Immunmarkierung für NTPDase2 verschwindet nach P5, zu einem Zeitpunkt, an dem sich die Radialglia in Astrozyten umwandelt. NTPDase2 ist daher auch ein Marker für eine Subpopulation kortikaler Radialglia, die spät während der Kortexentwicklung auftritt. Offensichtlich ist wird die NTPDase2 nur im normal ausgebildeten Hippokampus exprimiert. Keine signifikante Immunmarkierung wurde im Hippokampus der beiden Mausmutanten Reeler (rl/) und BETA2/NeuroD gefunden, in denen die Ausbildung des Gyrus dentatus schwer gestört ist und nur wenige Neuronen einen rudimentären Gyrus dentatus ausbilden. Reeler-Mäuse exprimieren nicht das extrazelluläre Matrixprotein Reelin, welches für die normale Schichtenbildung kortikaler Neurone unerlässlich ist. BETA2/NeuroD ist ein basic helixloophelix Transskriptionsfaktor, der für die Reifung von Körnerzellen essentiell ist und den Übergang von undifferenzierten Vorläuferzellen zu differenzierten Körnerzellen reguliert. Immunfärbungen für NTPDase2 an hippokampalen Schnitten aus transgenen Mäusen, die das enhanced green fluorescent Protein (EGFP) unter der Kontrolle des humanen Promotors für das saure gliale Filamentprotein (GFAP) exprimierten, zeigten ein partielle Kolokalisation von NTPDase2 und EGFP in radiären Zellen des Gyrus dentatus. Die Untersuchungen zeigen weiterhin, dass die NTPDase2 sowohl von GFAP, Nestin, DCXund PSANCAM-positiven Zellen des Gyrus dentatus exprimiert wird. Die GFAP- und Nestinexprimierenden radialen Zellen werden generell als der Prototyp hippokampaler orläuferzellen betrachtet. Ein Kolokalisation von NTPDase2 und GFAP oder Nestin wurde in radialen Zellfortsätzen der Körnerzellschicht und der inneren Molekularschicht beobachtet. Beide Filamentproteine sind weitgehend koexprimiert. Die Expression von DCX zeigt dagegen den Übergang zu einem neuronalen Phänotyp an. Eine Kolokalisation mit DCX wurde nur auf der Ebene der Zellkörper und in proximalen radiären Fortsätzen, nicht aber in Fortsätzen innerhalb der Molekularschicht gefunden. Dagegen wiesen horizontal orientierte DCX-positive Zellen der SGL generell eine Doppelmarkierung mit NTPDase2 auf. Die Expression von DCX überlappt weitgehend mit der von PSANCAM, welches ebenfalls auf migrierenden Neuroblasten exprimiert wird. Die gegenwärtige Arbeit legt daher nahe, dass NTPDase2 nicht nur mit frühen Vorläuferzellen (Nestin, GFAP) assoziiert ist, sondern auch mit jungen sich differenzierenden Neuronen (DCX, PSANCAM). Ein quantitative Analyse von radialen Zellfortsätzen nach Doppelmarkierung ergab, dass fast die Hälfte der GFAP- und DCXpositiven Zellfortsätze auch positiv für NTPDase2 war. Im Falle von Nestin waren etwa drei Viertel der radialen Fortsätze auch NTPDase2positiv. Diese Befunde zeigen weiterhin, dass die NTPDase2-positiven Zellen eine beachtliche molekulare und auch funktionale Heterogenität aufweisen. Dagegen ist NTPDase2 nicht mit NeuN- und beta-IIITubulin kolokalisiert. Dies legt nahe, dass NTPDase2 nur von unreifen Neuronen exprimiert wird, bevor diese voll differenzierte Neuriten ausbilden. Zusammengefasst zeigen diese Befunde, dass die Expression von NTPDase2 auf Vorläuferzellen beschränkt ist und dass das Enzym Zellen fehlt, die eindeutige neuronale Merkmale ausgebildet haben. Die Assoziation von NTPDase2 mit sich teilenden Vorläuferzellen wurde zusätzlich durch die Inkorporation von BrDU validiert. Nach einer einmaligen intraperitonealen Injektion von BrdU wurden wurde der Gyrus dentatus ausgeschnitten, die Zellen wurden dispergiert und auf Objektträger zentrifugiert. Dort erfolgte der Immunnachweis von BrdU und NTPDase2. Zahlreiche BrdU-positive Zellen in der S-Phase (2 h nach der Injektion) waren auch positiv für NTPDase2. Dies legt nahe, dass NTPDase2positive Zellen proliferieren können. Der Anteil dieser Zellen stieg weiterhin etwa parallel zur BrdU-Inkorporation, was darauf hinweist, dass NTPDase2 für mehr als einen Zellzyklus mit den Vorläuferzellen assoziiert bleibt. Eine Vierfachmarkierung der BrdU-positiven Zellen mit DAPI, NTPDase2 und GFAP ergab, dass 2 h nach der Injektion die BrdU-markierten Zellen entweder positiv für GFAP oder NTPDase2 oder für NTPDase2 und BrdU waren. Alle diese Zelltypen weisen daher ein signifikantes Proliferationspotential auf und durchlaufen eine rasche Veränderung ihres Phänotyps. Eine Analyse der absoluten Zellzahlen ergab, dass alle untersuchten Phänotypen proliferieren wobei sich die höchste BrdU-Inkorporation in Zellen fand, die positiv für NTPDase2 und GFAP oder für GFAP allein waren. Die Verteilung der Marker war ähnlich wie diejenige, die bei er Analyse der radialen Zellfortsätze ermittelt wurde. Interessenterweise nimmt die Anzahl der BrDU-markierten Zellen, die nur für GFAP positiv sind, nicht mehr zu, auch nicht nach 72 h. Die bei weitem stärkste Zunahme ergab sich für Zellen, die nur NTPDase2-positiv waren. Zellen, die für NTPDase2 und GFAP positiv waren nahmen erst nach 72 h erheblich zu. Auch im relativen Anteil der Phänotypen ergaben sich auffällige Veränderungen. Die auffälligsten betrafen Zellen die entweder nur für NTPDase2 oder für BrdU positiv waren. Allerdings ist eine Analyse dieser Daten im Sinne der Erstellung eines linearen Fortentwicklungsschemas der Zelltypen schwierig. Es könnten die einzelnen Phänotypen unterschiedliche Proliferationsraten aufweisen, der Übergang vom einem zum nächsten Zelltyp mag zeitabhängig unterschiedlich erfolgen und die symmetrische versus nichtsymmetrische Zellteilung könnte zwischen den Zelltypen variieren. Man kann jedoch konstatieren, dass die hippokampale Expression der NTPDase2 auf den neurogenen Entwicklungsweg beschränkt ist, von den primären Vorläuferzellen zu den transienten Vorläufern. In weiteren Experimenten wurde analysiert, inwieweit die Vorläuferzellen des Hippokampus in vitro primäre und sekundäre Neurosphären ausbilden können und ob die NTPDase2 auf den kultivierten Stammzellen erhalten bleibt. Dazu wurde der Gyrus dentatus aus Gewebescheiben herausgeschnitten, dissoziiert und die Zellen wurden in Gegenwart der Wachstumsfaktoren EGF und bFGF kultiviert. Im Vergleich dazu wurden Neurosphären aus der SVZ kultiviert, von denen die Neurohsphärenbildung gut untersucht ist. Es stellte sich heraus, dass Zellen aus dem Gyrus dentatus keine robusten sekundären Neurosphären bilden können. Dies stimmt mit Beobachtungen anderer Autoren überein, dass der Hippocampus zwar proliferierende Vorläuferzellen aber nicht (wie die SVZ) multipotente Stammzellen besitzt. Die Ekto-Nukleotidase-Aktivität der hippokampalen Vorläuferzellen legt nahe, dass extrazellulären Nukleotiden eine funktionelle Bedeutung bei der Neurogenese im Gyrus dentatus zukommen könnte. Untersuchungen, die in Kollaboration mit der Arbeitsgruppe von Prof. Helmut Kettenmann am Max-Delbrück-Zentrum in Berlin durchgeführt wurden, zeigen, dass radiale Gliazellen P2X-Rezeptoren exprimieren. Zum Einsatz kamen transgene Mäuse, die GFP unter Kontrolle des Nestin-Promotors exprimieren. Von den fluoreszierenden Zellen wurden mit der Patch-Elektrode abgeleitet, während die Hippokampusschnitte mit ATP überspült wurden. Die Mehrheit der Zellen reagierte auf ATP mit einem Einwärtsstrom von Kationen. Weiterhin wurde die Expression des P2Y1-Rezeptors im Gyrus dentatus mittels in situ-Hybridisierung nachgewiesen. Markierte Zellen fanden sich in der SGL des Gyrus dentatus und in wenigen Fällen auch am Übergang von der GCL zur inneren Molekularschicht. Eine intensive Markierung lag auch im Hilus und in der CA3Region vor. Auch in der SVZ konnte die mRNA für den P2Y1-Rezeptor nachgewiesen werden. Gegenwärtig ist die funktionelle Bedeutung des nukleotidergen Signalweges bei der Neurogenese wenig verstanden. Extrazelluläre Nukleotide könnten in die Regulation der Zellproliferation oder auch der Zelldifferenzierung involviert sein, wobei die Ekto-Nukleotidasen die Verfügbarkeit der Agonisten kontrollieren. Es ist bekannt, dass Nukleotide mit Wachstumsfaktoren wie EGF und bFGF synergistisch auf die Zellproliferation wirken. Es erscheint weiterhin denkbar, dass sich die Expression unterschiedlicher Subtypen von P2Xund P2Y-Rezeptoren während der Entwicklung oder auch während des Fortschreitens der adulten Neurogenese ändert. Dadurch könnten Proliferation und Differenzierung differentiell verändert werden. Zusätzliche Untersuchungen müssen nun die Lokalisierung und funktionelle Bedeutung der verschiedenen purinergen Rezeptoren weiter aufklären, ebenso wie die Bedeutung der NTPDase2 und der freigesetzten Nukleotide. Die vorgelegten Untersuchungen stellen dafür einen wichtigen Meilenstein dar