Investigation of the proton movement during the O-E step in the catalytic cycle of the cytochrome c oxidase of Paracoccus denitrificans

Die vorliegende Arbeit befaßte sich mit der Untersuchung der Protonenbewegung während des O-E Schrittes im katalytischen Zyklus der Cytochrom-c-Oxidase von P. denitrificans. Die Zuordnung der Protonenbewegung zu den einzelnen Schritten des katalytischen Zyklus der Cytochrom-c-Oxidase ist immer noch ein Gegenstand zahlreicher Kontroversen. Obwohl von Ruitenberg et al. (2000) durch Spannungsmessungen gezeigt wurde, daß die Reduktion von Häm a während des ersten Elektrontransfers in das oxidierte Enzyme eine schnelle Protonenaufnahme von der gegenüberliegenden Seite der Membran bewirkt, wurden diese Ergebnisse angezweifelt. Daher sollte mit einer unabhängigen und direkten Methode herausgefunden werden, ob Protonen bereits während des ersten Schrittes des katalytischen Zyklus aufgenommen werden. Dazu wurde ns-zeitaufgelöste Blitzlicht-Absorptionsspektroskopie in Kombination mit pH-sensitiven Farbstoffen genutzt, und zwar sowohl mit Fluorescein kovalent an der Proteinoberfläche gebunden als auch mit Phenolrot löslich im Medium vorliegend. Zur kovalenten Kopplung von thiolreaktiven Farbstoffen mußten zuerst die nötigen Voraussetzungen geschaffen werden. Dazu wurde in dieser Arbeit ein Mutagenesesystems für sowohl Untereinheit I als auch Untereinheit II etabliert und eine oberflächencysteinfreie Variante und elf Einzelcystein-Varianten hergestellt, exprimiert und aufgereinigt sowie die Enzymaktivitäten überprüft. Danach wurde ein Protokoll zur Kopplung der Einzelcysteinvarianten mit Iodoacetamidfluoresein ausgearbeitet und die Varianten Fluorescein-markiert. Dabei zeigte es sich, daß nur sieben Varianten erfolgreich mit IAF reagierten. Mittels dieser AF-markierten Varianten konnte die Pufferkapazität an der Oberfläche der Cytochrom-c-Oxidase bestimmt werden. Es zeigte sich, daß die Pufferkapazität des Enzyms in Lösung im Vergleich zu Bakteriorhodopsin dreimal so groß ist, an der Oberfläche sogar 10-15mal so groß. Dies deutet auf eine hohe Anzahl protonierbarer Gruppen um die für die Markierung ausgewählten Aminosäuren im Bereich der Eintrittsstellen der Protonen hin. Die gezielte Übertragung eines Elektrons auf die Cytochrom-c-Oxidase erfolgte durch Licht anregbare Rutheniumkomplexe. In unserem Meßsystem war die Elektronentransfereffizienz von [Ruthenium(2,2‘-bipyridin)2]2quarterpyridin am höchsten. Nach einer sorgfältigen Optimierung der Meßbedingungen wie pH-Wert, Ionenstärke und Energie des Lasers konnte eine 10-15 %ige Reduktion von Häm a mit einer Zeitkonstanten von t = 13,7 ± 2,4 µs nachgewiesen werden. Die Protonenkonzentrationsänderungen im Medium konnten durch Phenolrot verfolgt werden. Durch den Vergleich von Funktionsvarianten, bei denen jeweils einer oder beide Protoneneingangswege blockiert sind, konnte ein Modell für die Protonenaufnahme und -abgabe während der Einelektronen-Reduktion der Cytochrom-c-Oxidase entwickelt werden. Dies konnte durch Messungen an in Liposomen inkorporierter wt Cytochrom-c-Oxidase verifiziert werden. Die Nettoprotonenaufnahme von der N-Seite der Cytochrom-c-Oxidase beträgt somit 0,3 H+ für das im O-E Schritt aufgenommene Elektron. Die Variante CS-I302C-AF wurde dazu genutzt, die Oberflächenladungsdichte an der N-Seite der Cytochrom-c-Oxidase zu bestimmen. Die Oberflächenladungsdichte auf der N-Seite des Enzyms in der Nähe zum Eingang des K-Wegs ist negativ und beträgt 0,5 e-/1000 Å2.This work describes a detailed analysis of proton movements during the O-E step in the catalytic cycle of the cytochrome c oxidase of P. denitrificans. The assignment of the proton movement to the individual steps of the catalytic cycle of the cytochrome c oxidase is still a subject of numerous controversies. Although Ruitenberg et al. (2000) demonstrated that the reduction of haem a during the first electron transfer into the oxidized enzyme causes a fast proton uptake from the opposite side of the membrane on the basis of potentiometric measurements, other investigations showed no such evidence (Verkhovsky et al. 2001). Therefore, it is essential to unravel the question whether protons are already taken up during the first step of the catalytic cycle applying an independent and direct method. An appropriate method is ns-time-resolved flashlight absorption spectroscopy in combination with pH-indicator dyes, both with fluoresceine covalently bound at the protein surface and with phenol-red soluble in the medium. For the covalent coupling of thiol-reactive dyes the necessary conditions had to be created at first. For this purpose a mutagenesis-system both for subunit I and subunit II is established and one variant without any cysteines at the surface and eleven single-cysteine variants were prepared, expressed, purified and examined for enzyme activity. Afterwards a protocol was established to couple these single-cysteine variants with Iodoacetamidofluoreseine (IAF). It is shown that only seven variants successfully reacted with IAF. With these AF marked variants the buffer capacity at the surface of the cytochrome c oxidase could be determined. It could be shown that the buffer capacity of the enzyme is three times larger in solution as compared to bacteriorhodopsin, at the surface even 10-15 times. This result implies a high number of protonable groups around the IAF-labeled amino acids within the range of the proton entrances. The transfer of an electron to the cytochrome c oxidase was induced via light-activated ruthenium complexes. In our system the electron transfer efficiency of [Ruthenium(2,2‘-bipyridin)2]2quarterpyridine was highest. After carefully optimizing the conditions such as pH value, ionic strength and laserpower, a reduction of haem a of 10-15 % could be proven with a time constant of t = 13.7 ± 2.4 µs. The changes of proton concentration in the medium could be detected with phenol-red. After comparing functional variants with one or both proton entrance pathways blocked, a model for the proton uptake and release could be developed during the one-electron-reduction of the oxidized cytochrome c oxidase. This could be verified by measurements on wt cytochrome c oxidase incorporated into liposomes. The net proton uptake of the cytochrome c oxidase from the N-side amounts to 0.3 H+ for the electron taken up in the O-E step. The variant CS-I302C-AF was used to determine the surface charge density at the N-side of the cytochrome c oxidase. The surface charge density on the N-side of the enzyme in proximity to the entrance of the K-pathway is negative and amounts to 0.5 e-/1000 Å2