The meaning of phosphorylation of the aminoacids serine 1177 and threonine 495 for the activity of the endothelial NO synthase

Fragestellung: In zahlreichen Studien wurden die Regulationsmechanismen der endothelialen NO-Synthase aufgedeckt und untersucht. Neben vielen Faktoren, die bei der Aktivierung eine Rolle spielen, kommt der Phosphorylierung einzelner Aminosäuren des Proteins eine besondere Bedeutung zu. In dieser Arbeit werden die Aminosäure Threonin 495 und Serin 1177 untersucht mit der speziellen Fragestellung nach einer synergistischen Wirkung. Zielsetzung: Unter der Annahme, dass sowohl die Dephosphorylierung an Thr 495 als auch die Phosphorylierung an Ser 1177 zur Aktivierung der eNOS beitragen, wurde eine eNOS-Mutante untersucht, die an Thr 495 antiphosphomimetisch und an Ser 1177 phosphomimetisch substituiert wurde. Diese wurde in Bezug auf die Relaxationsfähigkeit mit dem Wildtyp der eNOS und einer eNOS verglichen, die ausschliesslich an Ser 1177 phosphomimetisch substituiert wurde. Material und Methoden: Für die Experimente wurden Knock-out-Mäuse verwendet deren Endothelzellen keine NO-Synthase exprimiert. Mit Hilfe eines Adenovirus als Vektor wurden die Endothelzellen der Arteria Carotis mit den entsprechenden eNOS Mutanten transfiziert. Im Organbad konnte das intakte Gefäß unter physiologischen Bedingungen auf die Reaktion nach Gabe von vasoaktiven Substanzen untersucht werden. Ergebnisse : Mit Hilfe der entwickelten Methode ist es möglich, die Relaxationsfähigkeit von Gefäßen aus eNOS-Knock-out-Mäusen wieder vollständig herzustellen. Im Relaxationsverhalten nach Stimulation mit Acetylcholin zeigten Gefäße, die jeweils mit einer der drei eNOS-Mutanten transfiziert waren, keinen großen Unterschied. Zur Vorspannung der Gefäße wurde jedoch deutlich mehr Phenylephrin benötigt bei den Gefäße, die mit der T495A/S1177D eNOS transfiziert waren. Nach Hemmung mit L-NAME kontrahierten diese Gefäße am stärksten und sie zeigten auch die höchste intazelluläre Konzentration basalen cGMPs im RIA. Schlussfolgerung : Die alleinige Phosphorylierung von Serin 1177 führt nicht zu einer vollständigen Aktivierung der eNOS, während eine Phosphorylierung an Serin 1177 in Kombination mit einer Dephosphorylierung von Threonin 495 die NO Produktion steigert und diese Endothelzellen basal hohe Konzentrationen an NO enthalten.Introduction: In addition to several other mechanisms, the phosphorylation of specific amino acids within the protein plays a major role in the activation of endothelial NO synthase (eNOS). This work focuses on the function of the amino acids threonine 495 und serine 1177 within the eNOS protein particularly with regard to a synergistic effect on enzyme activity. Objective: Recent studies suggested that the dephosphorylation of threonine 495 as well as the phosphorylation of serine 1177 contribute to the activation of eNOS. We examined an eNOS-mutant with phosphomimetic substitution at serine 1177 by aspartat and antiphosphomimetic substitution at threonine 495 by alanine. This mutant was compared with a wildtyp-eNOS and an eNOS substituted at serine 1177 on its effect on vasomotor function in an ex vivo overexpression system. Material and methods: In these experiments knockout mice were used, which do not express eNOS (eNOS -/-). With an adenovirus as a vector, endothelial cells were transfected from the luminal side with the different eNOS-mutants. This approach allowed an expression confined to the endothelium. In organbath chambers the endothelium dependent, NO mediated vasomotor function of intact blood vessels was subsequently examined under physiological conditions. Results: Using this method a selective gene transfer into endothelial cells was achieved. Endothelial eNOS transfection restored endothelial-dependent relaxation in isolated carotid arteries. Vessels transfected with the three different eNOS-mutants showed no significant difference in the relaxation induced by acetylcholine, but the T495A/S1177D-eNOS required more phenylephrine to reach a contraction level comparable to the other forms studied. Moreover, consistent with higher basal NO release, the contraction to eNOS inhibition was significantly enhanced in blood vessels transfected with T495A/S1177D-eNOS. Finally, these vessels also showed the highest intracellular concentrations of cGMP under basal conditions as compared to the other forms. Conclusion: The isolated phosphorylation of serine 1177 in eNOS does not lead to altered NO dependent vascular effect. In contrast, phosphorylation of serine 1177 in combination with a dephosphorylation of threonine 495 induces enhanced basal NO production by increasing the constitutive activity of eNOS