Investigating the apoptosis-resistance of malignant gliomas : molecular mechanisms and new therapeutic strategies

Maligne Gliome sind die häufigsten Neoplasien des Zentralen Nervensystems. Sie zählen zu den hypoxischsten Tumoren und entwickeln u.a. durch die Adaption an niedrige Sauerstoffbedingungen Apoptose-resistente Phänotypen. Darüber hinaus zeichnen sie sich durch schnelle Proliferation und ein diffuses, infiltratives Wachstum in das umliegende Neuropil aus, was eine vollständige Tumor-Resektion unmöglich macht. Entsprechend liegt die mediane Überlebenszeit nach der Diagnose trotz chirurgischen Eingriffs bei anaplastischen Astrozytomen (WHO Grad III) zwischen 18 und 20 Monaten und bei Glioblastomen (WHO Grad IV) zwischen 12 und 15 Monaten. Im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurden 17 Gliomzelllinien in einem in vitro-Anoxiemodell auf ihre Hypoxie-Sensitivität hin untersucht. Dabei wurde eine hohe Variabilität hinsichtlich der Hypoxie-Toleranz festgestellt, sowie die Tendenz zu einer ausgeprägter Anpassung an niedrige Sauerstoffverhältnisse, begleitet von der Fähigkeit, das mitochondriale Membranpotential (delta psi m) aufrecht zu erhalten. Der durch Hypoxie induzierte Zelltod wurde als Caspase-unabhängig und Nekrose-ähnlich charakterisiert. Apoptose wurde hingegen auch in den Hypoxie-sensitiven Zelllinien nach 48 stündigem Sauerstoffentzug nur in sehr geringem Ausmaß beobachtet. Funktionelle Analysen mit den synthetischen BH3-Mimetika HA14-1 und BH3I 2’, die selektiv Bcl-2 bzw. Bcl xL/Bcl-2 inhibieren, lassen darauf schließen, dass die für Gliomzellen typische Bcl-2- und Bcl xL-Überexpression eine Blockade des mitochondrialen Signalwegs verursacht und so entscheidend zur Apoptose-Resistenz der Zellen beiträgt. Der Todesligand TRAIL, der selektiv in Tumorzellen Zelltod aktiviert, ist ein vielversprechender Kandidat für neue Apoptose-induzierende Krebstherapien. Da jedoch einige Krebszelltypen einschließlich maligner Gliome weitgehend gegen TRAIL resistent sind, richtet sich das Interesse verstärkt auf kombinatorische Therapieansätze, die Tumorzellen für TRAIL resensitivieren sollen. Nur zwei von sechs untersuchten Gliomzelllinien reagierten auf die Behandlung mit TRAIL, wobei eine Korrelation zwischen Hypoxie- und TRAIL-Resistenz deutlich wurde und die Hypothese einer ausgeprägten Kreuzresistenz stärkt. Ein Zusammenhang zwischen TRAIL-Sensitivität und TRAIL-Todes- bzw. –Decoy-Rezeptor-Expression konnte indes nicht hergestellt werden. Der Vergleich von konventionellen Therapienansätzen (Gamma-Bestrahlung) mit neuartigen Wirkstoffklassen (BH3-Mimetika und Proteasomeninhibitoren) zeigte, dass Gamma-Bestrahlung lediglich in TRAIL-sensitiven Zellen synergistisch mit TRAIL wirkte, während die BH3-Mimetika den TRAIL-induzierten Zelltod sowohl in TRAIL-sensitiven als auch –resistenten Zellen signifikant erhöhten. Diese Befunde legen nahe, dass die hohen Bcl-2- und Bcl xL-Proteinlevel verschiedene Signalwege hemmen, die an den Mitochondrien konvergieren und dadurch die Apoptose- bzw. Therapie-Resistenz maligner Gliome steigern. Der Einsatz der Proteasomeninhibitoren MG132 und Epoxomicin erwies sich vergleichsweise als am effizientesten: Beide Substanzen vervielfachten p53-unabhängig den TRAIL-induzierten Zelltod in TRAIL-sensitiven Gliomzellen und reaktivierten darüber hinaus potent die TRAIL-induzierte Apoptose in den TRAIL-resistenten Zelllinien. Microarray- und semi-quantitative RT-PCR-Analysen ergaben eine potente transkriptionelle Aktivierung des TRAIL-Rezeptors DR5 und der Stress-induzierten Transkriptionsfaktoren CHOP und c-Jun. Weitere Untersuchungen mit Hilfe von chemischen Inhibitoren und RNA-Interferenz zeigten, dass die CHOP-unabhängige, JNK/c-Jun-Signalwegs-vermittelte Aktivierung von DR5 eine maßgebliche Rolle bei der Proteasomeninhibitor-induzierten Sensitivierung von Gliomzellen für TRAIL spielt. Zusammengenommen legen die vorgelegten Befunde nahe, dass neue Ansätze basierend auf TRAIL oder agonistischen TRAIL-Rezeptor-Antikörpern in Kombination mit Proteasomeninhibitoren oder BH3-Mimetika vielversprechende Strategien zur Überwindung der Therapieresistenz maligner Gliome darstellen.Malignant gliomas are the most frequent neoplasms of the central nervous system. They are among the most hypoxic tumours and develop apoptosis-resistant phenotypes due to the hypoxia-adaption of the cells. Furthermore they are characterized by rapid proliferation and a diffuse infiltrative growth into the surrounding neuropil foreclosing a complete resection of the tumour. Hence the median survival of patients with an astrocytoma (WHO grade III) or with a glioblastoma (WHO grade IV) is 18 to 20 month and 12 to 15 month, respectively. In the first part of this study 17 glioma cell lines were investigated for their hypoxia-susceptibility in an in vitro anoxia model. Hypoxia tolerance of the cell lines was highly variable with a tendency to hypoxia-adaption accompanied by the ability to maintain the mitochondrial membrane potential (delta psi m). Hypoxia induced cell death was characterized as a caspase-independent and necrotic-like form of cell death. Apoptosis was rarely observed even after 48 hours of severe hypoxia. Functional analyses with the synthetic BH3 mimetics HA14-1 and BH3I-2’ which selectively inhibit Bcl-2 and Bcl-xL/Bcl-2 respectively indicate that the overexpression of both proteins leads to a blockade of the mitochondrial apoptosis pathway and promotes apoptosis-resistance of the cells. The TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL) selectively induces apoptosis in tumour cells and is a promising candidate for new apoptosis-related cancer therapies. However some cancer-types including malignant gliomas are widely resistant to TRAIL. Therefore a lot of effort has been put into identifying combinatorial approaches to re-sensitize these cells to TRAIL-induced apoptosis. In this study only two out of six glioma cell lines responded to TRAIL revealing a correlation between hypoxia- and TRAIL-resistance and strengthening the hypothesis of a marked cross-resistance. There was no correlation between TRAIL susceptibility and TRAIL-death- and decoy-receptor expression. In a comparison of conventional therapy-approaches (gamma irradiation) and new substance classes (BH3 mimetics and inhibitors of the proteasome) gamma irradiation exerted a synergistic effect on TRAIL only in TRAIL-sensitive cells while BH3 mimetics significantly enhanced TRAIL-induced cell death in both TRAIL-sensitive and –resistant cell lines. These results indicate that high amounts of Bcl-2 and Bcl-xL hamper different pro-apoptotic signalling pathways converging at the mitochondria promoting apoptosis- and therapy-resistance of malignant gliomas. The proteasome inhibitors MG132 and Epoxomicin showed the strongest synergistic effect with TRAIL as they potentiated TRAIL-induced cell death in both TRAIL-sensitive and –resistant cell lines in a p53-independet fashion. Microarray- and semi-quantitative RT-PCR-analyses revealed a potent transcriptional activation of the TRAIL-receptor DR5 and the stress-induced transcription factors CHOP and c-Jun. Ensuing investigation by means of chemical inhibitors and RNA-interference indicated that the CHOP-independent JNK/c-Jun-mediated activation of DR5 after proteasome inhibition contributes significantly to the sensitization of glioma cells to TRAIL. Taken together, these results suggest that new approaches based on TRAIL or agonistic TRAIL-receptor antibodies in combination with proteasome inhibitors or BH3 mimetics are promising strategies to overcome the therapy-resistance of malignant gliomas