Screening auf genetische Polymorphismen des nukleären Vitamin-D-Rezeptors und ihre funktionelle Charakterisierung bei Typ-1-Diabetes-Mellitus

Autoimmune Endokrinopathien entstehen durch die Aktivierung pathogener TLymphozyten, welche in de Lage sind, bestimmte Ziel-Zellen mittels Zytokinen oder anderer Mechanismen zu zerstören. Typ I Diabetes mellitus ist ein durch Insulinmangel bedingter Defekt der Glukoseverwertung, der durch eine autoimmune Zerstörung der pankreatischen Beta-Zellen verursacht wird. Als häufigste chronische Erkrankung Jugendlicher und junger Erwachsener in den Industrienationen stellt sie durch ihre stetig steigende Inzidenz, ihr immer früheres Erkrankungsalter und nicht zuletzt die steigende allgemeine Lebenserwartung eine bedeutende medizinische und ökonomische Herausforderung dar. Die zunehmende Aufklärung der mannigfaltigen Wechselbeziehungen des Immunsystems und der starke Einfluss des Vitamin D auf die Entwicklung und Funktion des Immunsystems führten zu der Überlegung, dass auch der Vitamin D Rezeptor (VDR) in Verbindung mit seinem biologisch aktivsten Liganden 1,25 (OH)2D3 einen Einfluss auf die Entwicklung einer Autoimmunendokrinopathie haben könnte. In Tierexperimenten konnte gezeigt werden, dass 1,25 (OH)2D3 und auch seine Analoga die Produktion des Interleukins IL-12 hemmen, welches eine wichtige Rolle in der Entwicklung der Th1-Helferzellen ausübt, gleichzeitig wird die Produktion des Interleukins IL-10 stimuliert, welches die Entwicklung von Th1-Helferzellen blockiert. Dieser Zelltyp ist bei der Entwicklung eines Typ 1 Diabetes mellitus ursächlich beteiligt. 1,25 (OH)2D3 kann auch die Entwicklung der Th2 Helferzellen inhibieren, welche in der Pathogenese einer Hashimoto Thyreoiditis involviert sind. In betroffenen Geweben, in denen pathogen-wirksame Th1-Zellen die Bildung zytotoxischer T-Zellen und aktivierter Makrophagen bewirken, kann 1,25 (OH)2D3 und seine Analoga die Anzahl der Th1-Zellen herunterregeln. Des weiteren regt Vitamin D die Bildung von CD4+CD25+-regulatorischen T-Zellen und Th2-Zellen an, die ihrerseits wiederum hemmend auf Th1-Zellen wirken. Bisher haben bereits diverse Studien bestätigt, das funktionelle Auswirkungen verschiedener Einzelnukleotid-Polymorphismen in kodierenden und nicht kodierenden Regionen des VDR- Gens in kausalem Zusammenhang mit dem Auftreten eines Typ 1 Diabetes Mellitus stehen. In dieser Arbeit zeigten sich erniedrigte 1,25 (OH)2D3 Spiegel in deutschen Patienten mit Typ 1 Diabetes Mellitus. Eine vergleichbare Studie wurde in der finnischen Bevölkerung durchgeführt und bestätigt unsere Resultate. Dies spiegelt die zentrale Rolle des Vitamin D bei der Entwicklung eines Typ 1 Diabetes Mellitus wieder. Um den kausalen Zusammenhang zwischen molekularen und funktionellen Beziehungen des Vitamin D Rezeptors näher zu definieren, liegt die Frage nahe, inwiefern eine Korrelation der schon bekannten VDR- Polymorphismen und neu etablierten mit Vitamin D Spiegeln in Patienten und Kontrollen besteht, weiterhin, ob auf der Ebene der Genexpression schon ein signifikanter Unterschied bei Patienten mit Typ 1 Diabetes Mellitus zu beschreiben ist. Zusätzlich wurden sieben neue VDR- Polymorphismen in Familien, mit jeweils einem an Typ 1 Diabetes Mellitus erkrankten Kind, untersucht. Bestimmte Transmissionsmuster wurden bereits für die VDR- Polymorphismen ApaI, BsmI, FokI und TaqI bei Typ 1 Diabetes Mellitus beschrieben und eine signifikante Korrelation hergestellt. In dieser Doktorarbeit zeichnet sich eine grenzwertig signifikante Korrelation zwischen dem VDR- Polymorphismus 2238135 und Typ 1 Diabetes Mellitus ab. Das Allel „C“ wurde häufiger auf die erkrankten Kinder transmittiert. Dieses Ergebnis ließ sich ebenfalls in der Gegenüberstellung von Patienten zu Kontrollen nachweisen, in der Allelfrequenzanalyse stellte sich das Allel „C“ ebenfalls als dominant heraus. Für die anderen sechs untersuchten VDR- Polymorphismen konnte keine signifikante Korrelation zu Typ 1 Diabetes Mellitus in der deutschen Population nachgewiesen werden. Jedoch konnten bei vier der sieben VDR- Polymorphismen signifikante Haplotypen beschrieben werden, die den Zusammenhang zu Typ 1 Diabetes Mellitus erneut bestätigen. Dies zeigt, wie die alleinige Analyse eines VDR- Polymorphismus scheinbar keine Assoziation zum Typ 1 Diabetes Mellitus zu haben scheint, aber durch die Bildung von Allelkombinationen sich signifikante Korrelationen für die gleichen Polymorphismen ausbilden können. Die gemeinsame Analyse verleiht den untersuchten VDR-Polymorphismen erst die Signifikanz. Das Gleichgewicht war jedoch deutlich zugunsten der signifikant seltener transmittierten und damit protektiven Haplotypen verschoben. Nur „GCTG“ wurde häufiger transmittiert (62,7% vs. 37,3%, p= 0,0087), während die folgenden 3 Haplotypen „TCTG“, „TCGG“ und „GCGG“ seltener transmittiert wurden und sich als signifikant herausstellten. „TCGG“ stellte sich als grenzwertig signifikanter Haplotyp heraus, während „GCGG“ als signifikante Allelkombination anzusehen ist. Am stärksten jedoch zeigte sich der diabetogen- protekive Effekt beim Screening des „TCTG“ Haplotypen, der fast gar nicht an die erkrankten Nachkommen transmittiert wurde (99,1% vs. 0,9%, p= 0,0006). In der vorliegenden Doktorarbeit bestätigt sich einerseits die molekulare Korrelation zwischen bestimmten Polymorphismen des VDR- Gens und dem Auftreten eines Typ 1 Diabetes Mellitus. Andererseits konnten vier neue Haplotypen bestimmt werden, die im Rahmen des durchgeführten Screenings in der deutschen Bevölkerung das Risiko für die Entstehung eines Diabetes als schützende oder prädisponierende Faktoren mitbestimmen. 1,25(OH)2D3, der stärkste immunregulatorische Vitamin D Metabolit, stellt für die medikamentöse Prävention und Therapie der autoimmunen Erkrankungen auch weiterhin ein interessantes Ziel dar, unter Umständen auch über die Beeinflussung seiner Stoffwechselwege, deren molekulare Korrelation hier weiterführend geklärt wurde.Autoimmune endocrinopathies are caused by the activation of pathogenic T lymphocytes, which are capable of destroying certain cells trough cytokines or by other mechanisms. Type I diabetes mellitus is a defect of the glucose metabolism which results from the lack of insulin which is caused by the autoimmune destruction of pancreatic beta cells. Among young adults in developed nations type I diabetes mellitus is one of the most common chronic diseases and in connection with constantly increasing incidence, the rise of earlier age onset as well as the increased life expectancy, it is a major challenge from a medical and economic point of view. The increasing clarification of the immune system’s various interrelations and the eminent influence of vitamin D on the immune system’s function and development have led to the assumption that the vitamin D receptor (VDR) in connection with its biologically most active ligands 1,25(OH)2D3 might also have influence on the development of autoimmune endocrinopathies. Animal experiments have shown that 1,25(OH)2D3 and its analogues impair the production of the interleukin IL-12, which plays an essential role for the development of Th 1 helper cells. At the same time, the production of the interleucine IL-10 is activated, which inhibit the development of Th 1 helper cells. This cell type is etiologically involved in the development of Type I diabetes mellitus. In the affected tissue, in which pathogenic Th1 cells cause the production of cytotoxic T cells and activated macrophages, 1,25(OH)2D3 and its analogues can decrease the amount of Th1 cells. Moreover, vitamin D stimulates the development of CD4+CD25+regulatory T cells as well as Th2 cells, which in turn acts by inhibiting Th1 cells. Until now, diverse clinical trials showed functional impacts of different single nucleotid polymorphisms in coding and non-coding regions of the VDR gene to be associated with Type I diabetes mellitus. This doctoral thesis showed lowered 1,25 (OH)2D3 levels in German patients affected by Type 1 diabetes mellitus. A comparable survey in Finland corroborates our results. This reflects the central role of vitamin D for the development of a Type I diabetes mellitus. In order to closely define the causal associations between molecular and functional relationships of the vitamin D receptor, the question is to what extent there exists a correlation of previously and newly established structures of VDR polymorphisms in patients compared to healthy controls and their vitamin D levels and if on the gene expression level one can describe a significant discrepancy in type 1 diabetes. Additionally, seven VDR polymorphisms in families, in which one child is diagnosed with Type 1 diabetes, have been examined. Certain transmission patterns for the VDR polymorhisms Apal, Bsml, Fokl undTaql in Type 1 diabetes mellitus have already been described and a significant correlation has been made. In this research work, a marginally significant correlation between VDR polymorphism 2238135 and Type 1 diabetes mellitus emerges. The allele C was more frequently transmitted to the affected children. This result could also be confirmed within the comparison of patients and healthy controls because in the allele frequency analysis the allele C turns out to be dominant. For the remaining six VDR polymorphisms which have been examined, no significant correlation in connection with Type 1 diabetes mellitus could be proven in the German population. However, in four out of seven VDR polymorphisms significant haplotypes could be found, which again corroborate the connection with Type 1 diabetes mellitus. This shows that a single analysis of a VDR polymorphism seems to have no association to type 1 diabetes; however, the development of allele combinations can cause significant correlations for the same polymorphisms. It is the collective analysis that finally gives significance to the examined polymorphisms. Nevertheless, the balance was considerably adjusted to the significantly rarely transmitted and therefore protective haplotypes. Soley “GCTG” has been more frequently transmitted (62,7% vs. 37,3%, p= 0,0087), whereas the following three haplotypes "TCTG“, „TCGG“ und „GCGG” were rarely transmitted and turned out to be significant. „TCGG“ turned out to be a marginally significant haplotype, whereas „GCGG“ can be regarded as a significant allele combination. The most outstanding diabetogenic effect could be seen during the screening of the „TCTG“ haplotype, which was nearly always transmitted to the affected offspring (99,1% vs. 0,9%, p= 0,0006). On one hand this thesis proves the molecular correlation between certain polymorphisms of the VDR gene and Type I diabetes mellitus. Four new haplotypes could be defined in the family analysis. These studies underline the role of the vitamin D system as a candidate for future screening and prevention strategis