Adenosiini analoogi ja oligoarginiini konjugaatidel põhinevad proteiinkinaaside inhibiitorid

Väitekirja elektrooniline versioon ei sisalda publikatsioone.Valkude fosforüleerimisreaktsioon elusorganismides ning seda katalüüsivad valgud – proteiinkinaasid – on olnud loodusteadlaste tähelepanu keskpunktis alates 1950-test aastatest, kui E. P. Kennedy, E. H. Fischeri, E. G. Krebsi, E. W. Sutherlandi ja W. D. Wosilaiti tööd avasid kinaaside ajastu [Cohen P., 2002]. Proteiinkinaasid osalevad enamikes raku elutegevuseks olulistes protsessides, seetõttu on häired nende ensüümide funktsioneerimises (eriti kõrgendatud aktiivsus) seotud mitmete haigustega (sealhulgas vähkkasvajad, diabeedid ja astma). Sellest tulenevalt keskenduvad nii akadee¬miliste teadlaste kui ka farmaatsiafirmade ravimiarendajate huvid üha enam kinaaside toimemehhanismide uurimisele ja võimaluste selgitamisele rakusiseste valkude fosforüleerimistasakaalude mõjutamiseks. Viimase ülesande lahendamisel on üheks perspektiivsemaks teeks proteiinkinaaside inhibiitorite arendus. Käesolev töö kirjeldab adenosiini analoogi ja arginiinirikka peptiidi konjugaatide (ARC-de) arendamist proteiinkinaaside bisubstraatseteks kõrge inhibeerimispotentsiaaliga ligandideks, nende inhibiitorite disaini ja sünteesi. Uudsete ARC-de arendamisel lähtuti tulemustest, mis saadi inhibiitorite struktuuri mõju uurimisel nende sidumis- või inhibeerimisomadustele toimes cAMP-sõltuva proteiinkinaasiga (PKA) ning sama proteiinkinaasi ARC-dega kooskristalliseerimisel saadud struktuuride röntgenanalüüsil. Töö tulemusena õnnestus valmistada kaks uut ARC-tüüpi inhibiitorite põlvkonda (ARC-II ja ARC-III). Seejuures oli ARC-II kõige efektiivsema esindaja (ARC-903) IC50 väärtus PKAc inhibeerimiskatsetes 5,3 nM ning ARC-III kõige efektiivsema esindaja (ARC-1028) IC50 väärtus väljatõrjumiskatsetes PKAc-ga alla 0,5 nM. Järgmise sammuna määrati ARC-II ja ARC-III kõige efektiivsemate ühendite selektiivsusprofiilid; ühendid osutusid rühm-selektiivseteks inhibiitoriteks mitmete basofiilsete proteiinkinaaside, eriti AGC-rühma esindajate suhtes. Edasistes uuringutes tehti kindlaks, et tulenevalt uute ARC-de suhteliselt laiast selektiivsusprofiilist oli võimalik rakendada ARC-del põhinevat sidumismeetodit (FA-meetod) kinaasiaktiivsuse hindamiseks ning proteiinkinaasi-inhibiitorite iseloomustamiseks mitte ainult eelnevalt mudelkinaasina kasutatud PKA jaoks, vaid ka viimasega struktuurselt sarnase PKGI jaoks. Töö viimases etapis demonstreeriti, et uute ARC-de rakendusala ei piirdu biokeemiliste mõõtmismeetoditega, vaid see on laiendatav in vitro katsetele elusrakkudes ja –kudedes. ARC-II ja ARC-III efektiivsemate esindajate proteolüütiline stabiilsus ja võime läbida raku plasmamembraani võimaldasid uurida uusi inhibiitoreid roti isoleeritud ajuarterite silelihaskoes. Nende katsetuste tulemusena selgus, et ARC-d suudavad inhibeerida cAMP/PKA ja cGMP/PKG radu füsioloogilistes tingimustes.Since the pioneering works by E. P. Kennedy, E. H. Fischer, E. G. Krebs, E. W. Sutherland and W. D. Wosilait in 1950s [Cohen P., 2002], protein phosphorylation has been one of the most thoroughly studied and discussed topics of the natural sciences. Protein kinases, the enzymes catalyzing phosphorylation have been termed „the machines of life“ for being involved in most processes of cell regulation; the aberrant signalling of protein kinases has been connected to a variety of diseases, including cancer, diabetes, and asthma. Consequently, an increasing amount of effort has been focussed on the investigation and implication of mechanisms responsible for the regulation of protein kinase activity, giving stimulus for the intense development of protein kinase inhibitors. The present thesis focussed on design, synthesis and in vitro characterization of new conjugates of adenosine analogues and arginine-rich peptides as inhibitors of basophilic protein kinases. Two new sets of ARCs (subsequently termed as ARC-II and ARC-III) were develped, whereas the most efficient representative of ARC-II (ARC-903) possessed inhibition IC50 value of 5.3 nM towards PKAc and the most efficient representative of ARC-III (ARC-1028) demosntrated the competitive displacement IC50 value of less than 0.5 nM towards PKAc. The profiling of representatives of ARC-II and ARC-III towards a panel of PKs indicated that the novel ARCs were group-selective inhibitors possessing high affinity towards several PKs of the AGC-group. Subsequently, the wide applicability of novel ARCs was confirmed by development of ARC-based biochemical in vitro assays for PKAc and PKGI with detection of change of fluorescence anisotropy (FA), fluorescence intensity (FI), or FRET. Finally, the potential of novel ARCs as physiological modulators was demonstrated in the internalization studies with the isolated smooth muscle tissue, and in vasoconstriction experiments with isolated rat arteries (via targeting cAMP/PKA and cGMP/PKG pathways). Keywords: protein kinases, bisubstrate inhibitors, ARC, methods with fluorescence detection, smooth muscle tissue