Identification des mécanismes moléculaires impliqués dans la résistance des cellules à une carence en acides aminés.

Tumor development can be characterized by the formation of hypoxic area deprived in nutrients. Due to their genetic instability, tumor cells can become resistant to this apoptotic condition. Among the resistance mechanisms, those involved in cell survival against amino acids restriction is poorly known. Amino acids deprivation is particularly deleterious as nine of them cannot be synthetized de novo. The aim of this work was to identify the mechanisms by which tumor cells can survive to long-term amino acids deprivation. For that purpose, we exerted a selective pressure on mouse embryonic fibroblast by exposing them to amino acids deprivation for several months. We generated clones able to survive and proliferate in deprived amino acids medium. Firstly, we characterized the capacity of proliferation and survival of several resistant clones in amino acid deprivation condition. Secondly, we studied several signaling pathways which are regulated during this condition. We have found that every clones present an alteration of the GCN2 pathway, and notably, a low expression of its major actor, the protein ATF4, when compared to the parental cells. We have shown with shRNA experiment that this underexpression promotes cell survival during amino acid deprivation. The association between decreased expression of ATF4 and better survival in amino acid deprivation condition was also found in a pancreatic cancer cell line, BxPC-3. ATF4 overexpression in this resistant cell line restores the apoptotic effect of ATF4 during amino acid deprivation. We have also studied how cells can provide themselves in amino acids from the extracellular environment. We have observed that one of the clone cell line presents a high level of macropinocytosis and that, the inhibition of this mechanism decreases its survival during amino acid deprivation. Thanks to our approach, we were able to highlight mechanisms which confers to cell resistance to amino acid deprivation. By observing those mechanisms in cancer cell lines, we confirmed the relevance of our approach to identify such mechanisms.Le développement anarchique de tumeurs peut conduire à la formation de régions hypoxiques carencées en nutriments. A cause de l’instabilité génétique des cellules cancéreuses, certaines peuvent développer des résistances à ces conditions proapoptotiques. Parmi ces mécanismes de résistance, ceux impliqués dans la survie des cellules face à la carence prolongée en acides aminés n’ont pas été élucidés. La carence en acides aminés est particulièrement délétère pour les cellules de par leur importance dans le métabolisme cellulaire et l’impossibilité pour 9 d’entre eux d’être synthétisée de novo. L’objectif de ce travail était de déterminer les mécanismes permettant aux cellules cancéreuses de survivre face à la carence prolongée en acides aminés. Pour cela, nous avons développé un outil cellulaire par génétique fonctionnelle. Des fibroblastes embryonnaires de souris ont été soumis à une pression de sélection en les cultivant dans un milieu fortement carencé en acides aminés pendant plusieurs mois. Des clones capables de survivre et de proliférer dans ce milieu ont été générés. Le travail de thèse a d’abord consisté à caractériser la résistance de plusieurs clones à la carence en acides aminés et notamment, les voies de signalisation régulées par cette situation. Parmi ces dernières, nous avons pu observer que les clones par rapport aux cellules parentales présentaient une altération de la voie GCN2, et plus précisément, une sous-expression d’un des acteurs majeurs de cette voie, la protéine ATF4. Par des expériences de shRNA, nous avons pu mettre en évidence que cette sous-expression favorisait la survie des clones en milieu carencé en acides aminés. L’association entre survie et sous-expression d’ATF4 a également pu être faite dans une lignée de cancer du pancréas, BxPC-3. En rétablissant l’expression d’ATF4, les cellules résistantes redevenaient sensibles aux effets apoptotiques de la carence en acides aminés, confirmant le rôle apoptotique d’ATF4 lors de carence en acides aminés prolongée. Nous nous sommes également intéressés aux mécanismes que les cellules utilisaient pour se fournir en acides aminés à partir des protéines du milieu extracellulaire. Nous avons pu identifier qu’une des lignées de clones présentait un fort niveau de macropinocytose et que son inhibition lors de carence en acides aminés diminuait ses capacités de survie lors de carences en acides aminés. Notre approche a ainsi pu mettre en évidence des mécanismes de résistances des cellules à la carence en acides aminés. Ces mécanismes ont ensuite pu être observés dans des lignées cancéreuses, confirmant la pertinence de notre modèle pour l’identification de tels mécanismes