Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zu Prenyltransferasen aus Stigmatella aurantiaca und Aspergillus fumigatus

Prenylierte Naturstoffe sind in allen lebenden Organismen weit verbreitet und weisen häufig biologische Aktivitäten auf, die sich oft von ihren nicht prenylierten Vorstufen unterscheiden. Transferreaktionen von Isopreneinheiten von einem Prenyldonor auf ein Akzeptormolekül, wie z.B. ein Terpenoid, ein Serinrest oder einen Aromaten, werden von Prenyltransferasen katalysiert. Für die letzte Reaktion sind die sogenannten aromatischen Prenyltransferasen verantwortlich, die als membrangebundene oder lösliche Enzyme in Pflanzen, Pilzen und Bakterien auftreten und zu einer großen Vielfalt an Primär- und Sekundärmetaboliten beitragen. Im Laufe der letzten Jahrzehnte sind viele prenylierte Substanzen mit interessanten biologischen Aktivitäten aus Mikroorganismen isoliert worden, deren Biosynthese großteils noch unbekannt war. Zu diesen Naturstoffen gehörten unter anderem die Aurachine, eine Gruppe von Chinolinalkaloiden aus Myxobakterien. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation konnte das Gen auaA aus dem putativen Gencluster für Aurachinbiosynthese in dem Myxobakterium Stigmatella aurantiaca Sg a15 heterolog in E. coli exprimiert und das Genprodukt anschließend biochemisch charakterisiert werden. Dabei wurde eindeutig gezeigt, dass AuaA als eine Farnesyltransferase fungiert und die Bildung von Aurachin D durch Prenylierung von 2-Methyl-4-Hydroxychinolin an Position C3 des Chinolinrings katalysiert. Die enzymatische Reaktion folgte der Michaelis-Menten-Kinetik und war strikt abhängig von divalenten Metallionen. Die KM-Werte für 2-Methyl-4-Hydroxychinolin und FPP betrugen 0.27 mM und 0.043 mM und die maximale Reaktionsgeschwindigkeit 2.21 nmol/min*mg. AuaA zeigte Flexibilität gegenüber aromatischen Substraten, da es neben dem natürlichen Substrat auch sechs weitere 4 Hydroxychinoline akzeptierte und sogar zwei von sechs getesteten Flavonoiden in geringem Maße umsetzte. Im Gegensatz dazu war das Enzym relativ spezifisch in Bezug auf den Prenyldonor. Neben FPP akzeptierte AuaA zwar GPP, jedoch nur mit einer relativen Aktivität von 3.3 %. Mittels zielgerichteter Mutagenese wurden ausgewählte Aminosäurereste in den für membrangebundene aromatische Prenyltransferasen charakteristischen aspartatreichen Motiven in AuaA untersucht. Durch die Mutationen konnte die essentielle Bedeutung der konservierten Asparaginsäurereste bestätigt werden. Die Mutation des Arginins im ersten aspartatreichen Motiv (NRxxDxxxD) zeigte, dass die Aminosäure an zweiter Position in dem Motiv nicht direkt in die von AuaA katalysierte Reaktion involviert ist, was einen Unterschied zu LePGT1, einer weiteren Prenyltransferase dieser Enzymgruppe, darstellt. Die Enzyme FgaPT2, FtmPT1 und 7-DMATS aus Aspergillus fumigatus gehören zu aromatischen Prenyltransferasen der DMATS-Familie und katalysieren den Transfer eines Prenylrests auf einen Indolkörper. Anders als membrangebundene aromatische Prenyltransferasen enthalten sie keine konservierten aspartatreichen Motive zur Bindung des Prenyldiphosphates durch divalente Metallionen und ihre Aktivität ist ionenunabhängig. Diese Tatsache führte zu der Vermutung, dass in den Prenyltransferasen der DMATS-Familie basische Aminosäuren die Rolle der Metallionen bei der Koordination von Prenyldiphosphat übernehmen könnten. Mit Hilfe von zielgerichteter Mutagenese wurde die Bedeutung von drei konservierten basischen Aminosäureresten für die katalytische Aktivität der Prenyltransferasen FgaPT2, FtmPT1 und 7-DMATS untersucht. Die Experimente zeigten, dass zwei Lysinreste in die von allen drei Enzymen katalysierten Prenylierungsreaktionen involviert sind, während die Mutation des ausgewählten Argininrests nur in FgaPT2 zu einem deutlichen Aktivitätsverlust führte. Dies deutete darauf hin, dass dieser Argininrest in FtmPT1 und 7-DMATS nicht direkt an der Prenylierung beteiligt ist. Durch Aufklärung der Struktur von FgaPT2 und Analysen des Enzymkomplexes mit L-Tryptophan und DMASPP, dem Substratanalogon von Dimethylallyldiphosphat (DMAPP), konnte ein Prenylierungsmechanismus postuliert werden, bei dem die Aminosäurereste E89, R100 und K174 eine essentielle Rolle spielen sollten. Zur Überprüfung der Hypothese wurden diese Aminosäurereste mutiert und anschließend die Auswirkung der Mutationen auf die Aktivität von FgaPT2 untersucht. Der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Austausch von E89 und R100 bestätigte die essentielle Rolle dieser Reste für die Katalyse von FgaPT2. Dagegen konnte die Substitution von K174 durch Glutamin die Notwendigkeit dieser Aminosäure für den Reaktionsmechanismus nicht unterstützen