Rationales Enzymdesign zur Optimierung dimodularer Peptidsynthetasen

Die modular aufgebauten, multifunktionalen nichtribosomalen Peptid-synthetasen (NRPS) katalysieren in vielen Mikroorganismen die Produktion strukturell vielfältiger, pharmakologisch interessanter Naturstoffe. Für die Integration eines Bausteins in das wachsende Produkt ist jeweils ein Modul verantwortlich, welches seinerseits in einzelne Domänen unterteilt werden kann. Diese Domänen katalysieren die Erkennung, Aktivierung und den Einbau der Substrate. Aufgrund ihrer modularen Organisation stellen die NRPS ein geeignetes System für die gezielte Entwicklung artifizieller Enzyme dar. In dieser Arbeit wurden verschiedene Strategien der Domänen- und Modulfusion verfolgt, um dimodulare Synthetasen für die Produktion des Dipeptids alpha-Aspartyl-Phenylalanin (Asp-Phe), das als Vorläufer in der Produktion des Zuckerersatzstoffs Aspartam eingesetzt wird, zu entwickeln. Ein Vergleich von sechs Asp-Phe-Synthetasen verdeutlicht die Auswirkungen von künstlichen Fusionen auf die Aktivität der Enzyme. So konnten deutliche Unterschiede in der Umsatzrate sowie die von der Umsatzrate abhängige Synthese des Nebenprodukts beta-Asp-Phe beobachtet werden. Durch den Vergleich verschiedener Fusionsstrategien am Beispiel der Asp-Phe-Synthetasen konnte das Wissen über das Design hybrider Peptidsynthetasen erweitert werden. Die strukturelle Vielfalt nichtribosomal synthetisierter Peptide wird nicht zuletzt durch die Katalyse von modifizierenden Domänen gewährleistet. Eine spezielle Domäne ist die Heterozyklisierungs-(Cy)-Domäne. Sie katalysiert neben der Bildung einer Peptidbindung die Zyklisierung der Seitenkette von Cystein, Serin oder Threonin zu Thiazolin- bzw. Oxazolin-Ringen. In dieser Arbeit wurde, basierend auf den ersten beiden Modulen der Bacitracin-Synthetase A, ein Modellsystem zur Untersuchung der Cy-Domäne entwickelt, welches das heterozyklische Isoleucinyl-Thiazolinylcystein bildet. Ausgehend von diesem Modellsystem konnten durch Modulfusionen dimodulare Hybridsynthetasen konstruiert werden, deren Fähigkeiten, neue heterozyklische Produkte zu bilden, das biokombinatorische Potential der Cy-Domäne verdeutlichen. Zusätzlich konnte durch Mutation von konservierten Resten innerhalb der Cy-Domäne des Modellsystems die Reaktionsabfolge von Peptidbindungsbildung und Zyklisierung aufgeklärt werden. Anhand der erhaltenen, mutierten Synthetasen, die nur noch die Bildung der Peptidbindung aber nicht die nachfolgende Zyklisierung katalysieren, konnte der Beweis für die Unabhängigkeit von Kondensations- und Heterozyklisierungsreaktion innerhalb der Cy-Domäne erbracht werden