4 -Phosphopantethein Transfer in Bacillus subtilis und Pseudomonas aeruginosa sowie Grundlagen zur gerichteten Proteinevolution von Adenylierungsdomänen der Nichtribosomalen Peptidsynthetasen

Carrier Proteine (CP) werden in unterschiedlichen prokaryontischen und eukaryontischen Synthesesystemen als Transporteinheiten für die Syntheseintermediate eingesetzt. Im Primärmetabolismus dienen sie zum Transport von Acyleinheiten (Fettsäuresynthese) und D-Ala (Modifikation der Zellwand). Im Sekundärmetabolismus werden sie zur Beförderung von Aminoacyl/Peptidyl/Aryleinheiten (nichtribosomale Peptidsynthetasen, NRPS) und Ketoacyleineheiten (Polyketidsynthasen) eingesetzt. Die Intermediate werden am 4 -Phosphopantethein-Cofaktor (4 PP) des CP als Thioester gebunden. Der 4 PP-Cofaktor wird posttranslational von Coenzym A auf einen konservierten Serinrest des CP übertragen, katalysiert durch sog. 4 PP-Transferasen (PPTasen). E. coli besitzt zwei PPTasen. Die Acyl Carrier Protein Synthase (AcpS) modifiziert nur die CP des Primärmetabolismus, während EntD nur die CP des Sekundärmetabolismus bedient. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die beiden PPTasen von B. subtilis, AcpS und Sfp, überlappende Spezifitäten besitzen. Es zeigte sich, dass AcpS lediglich die CP des Primärmetabolismus modifiziert, während Sfp, das zwar alle CP erkennt, jedoch deutliche Präferenz für die CP des Sekundärmetabolismus hat. In P. aeruginosa wurde nur eine PPTase, PcpS, gefunden. Aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften ist PcpS eine PPTase des Sekundärmetabolismus. Biochemische Untersuchungen zeigten, dass sie, wie Sfp, alle CP modifizieren kann, jedoch evolutiv auf die Modifikation der CP des Primärmetabolismus optimiert wurde. Eine Deletion des zugehörigen Gens und RNA-interference zeigten, dass diese PPTase für P. aeruginosa essentiell ist. Weitere Untersuchung zur CP-PPTasen-Erkennung konnten außerdem die Interaktionsstelle zwischen beiden Proteinen aufdecken. Die Inhibierung der Adenylierungsdomänen (A-Domänen) der NRPS, die für die Selektion des Aminosäuresubstrats verantwortlich sind, durch Aminoacyl-Sulfamoyl Adenylatanaloga konnte im Rahmen dieser Arbeit erfolgreich auf eine A-Domäne des Primärmetabolismus übertragen werden. Ein Modifikation dieser Inhibitoren mit einem Linker erlaubt ihre Bindung an eine Matrix. Der Linker beeinflusst die inhibitorischen Eigenschaften z.T. nicht und kann den Einsatz dieser linkermodifizierten Inhibitoren zur gerichteten Proteinevolution von A-Domänen ermöglichen. Außerdem wurde zum Zweck der Evolution von A-Domänen ein Screeningsystem entwickelt. Dieses System basiert auf der in vivo beobachtbaren Lumineszenz der Luciferase. Damit kann eine A-Domänenbibliothek auf veränderte Selektivität in Richtung des Substrats der Luciferase, Luciferin, durchmustert werden