Untersuchungen zur Replikation und Transkription von Marburg- und Ebolavirus

Filoviren, zu denen das Marburg- (MARV) und das Ebolavirus Zaire (EBOV-Z) gehören, zählen zu den tödlichsten Humanpathogenen, gegen die es weder ein Therapeutikum noch einen Impfstoff gibt. Innerhalb der Mononegavirales besitzen sie das längste Genom (etwa 19 kb) und als einzige Mitglieder neben den Pneumoviren ein viertes Nukleokapsidprotein, VP30. Dieses dient beim EBOV als Transkriptionsaktivator, die Funktion für das MARV ist aber ungeklärt. In der vorliegenden Arbeit wurden die cis-aktiven Signale für Replikation und Transkription des MARV, EBOV-Z und Ebolavirus Reston (EBOV-R) untersucht und gemeinsame Motive verglichen. Weiter wurde ein Volle-Länge-Rescue-System für das MARV etabliert, mithilfe dessen die Rolle des VP30 untersucht wurde. Als ein Kooperationsprojekt wurden die inhibitorischen Eigen-schaften synthetischer DNA-Analoga auf die Vermehrung von EBOV-Z in Zellkultur analysiert. Die Sekundärstruktur des Transkriptionsstart-Signal (TSS) des MARV wurde mittels chemischer Modifizierung ermittelt und unterschied sich gravierend von der des EBOV-TSS. Wurde die bei EBOV-Z gebildete Sekundärstruktur zerstört, so war kein VP30 mehr für die Transkription notwendig (Weik et al., 2002). Chimären der beiden Sekun-därstrukturen führten zum Verlust der Transkription und zu starker Reduzierung der Replikationsfähigkeit; VP30 hatte dabei keinen Einfluss auf die Transkription. Durch weitere Experimente konnte gezeigt werden, dass wahrscheinlich die Primärsequenz entscheidend für die Replikation und Transkription ist und nicht die Sekundärstruktur. Mithilfe des rekonstituierten Minigenomsystems für EBOV-Z wurde der genomische Replikationspromotor eingehend untersucht. Es war bereits bekannt, dass zwei Promotorelemente vorliegen, und die dazwischenliegende Sequenz unwichtig war und nur um 6 nts verlängert oder verkürzt werden konnte, ohne die Replikation zu beeinträchtigen (Schlenz, 2002, Weik, 2001). In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass nur 3 von 8 vorkommenden UN5-Hexameren nötig sind, um Replikation zu unterstützen. Dieses Motiv wurde auch bei EBOV-R und MARV gefunden. Allerdings deuten die Daten darauf hin, dass der genomische Replikationspromotor des MARV nur aus einem Element besteht, in dem die Replikations- und Transkriptionssignale überlappen. Als ein sehr nützliches Hilfsmittel zur detaillierten Untersuchung des MARV wurde ein Volle-Länge-Rescue-System etabliert, in welchem rekombinantes MARV durch Transfektion des Antigenoms und Plasmiden der Nukleokapsidproteine VP30, VP35, NP und L erzeugt werden konnte. Somit war eine gezielte Manipulation des viralen Genoms möglich. Arbeiten mit rekombinanten Viren wurden in Kooperation mit Prof. Volchkov in Lyon durchgeführt. Mithilfe dieses Systems konnte gezeigt werden, dass VP30 eine wichtige Rolle für die effiziente Vermehrung des MARV in Zellkultur darstellt, obwohl eher eine strukturelle als katalytische Funktion angenommen wird. Bisher waren solche Untersuchungen nicht möglich, da VP30 im Minigenomsystem keine Funkti-on zukam. Zudem war es möglich, ein rekombinantes MARV zu erzeugen, welches 18 nts des Replikationspromotors des EBOV-Z inseriert hatte. Schließlich wurde eine Inhibition der Vermehrung des EBOV-Z in Zellkultur durch ein gegen die Translationsstart-Sequenz des VP35-Gens gerichtetes, peptidkonjugiertes Phosphorodiamidat-Morpholinooligomer (P-PMO) gezeigt. Die Daten zeigten eine sehr gute prophylaktische Nutzbarkeit, jedoch eingeschränkte Wirkung, wenn das P-PMO nach der Infektion appliziert wurde. Diese Ergebnisse wurden von der Kooperationsgruppe des USAMRIID in Mausexperimenten mit unkonjugierten PMOs bestätigt. Der Einsatz von (P)-PMOs zur Hemmung von VP35 ist ein vielversprechender prophylaktischer und evtl. sogar therapeutischer Ansatz für Filovirusinfektionen