Die stressprotektive Wirkung von Aminosäuren in Bacillus subtilis: Endogene Synthese von Prolin und die GltT - vermittelte Aufnahme von Glutamat und Aspartat zum Schutz vor Hyperosmolarität und Hitze

Bacillus subtilis akkumuliert unter hochosmolaren Bedingungen die Aminosäure Prolin via de novo Synthese als kompatibles Solut. Diese Synthese wird von den Enzymen ProJ, ProA und ProH vermittelt, wobei die Strukturgene proH und proJ als osmotisch kontrolliertes Operon exprimiert werden (Brill, 2002). In dieser Arbeit wurden die in cis benötigten Elemente für die osmoregulierte proHJ-Transkription lokalisiert. Mit Hilfe von Reportergenfusionen konnte ein minimales regulatorisches Fragment gefunden werden. Durch ortsgerichtete Mutagenesen dieses Fragmentes konnte geschlossen werden, dass sich die gesuchten cis-Elemente in der 5´untranslatierte Region von proH befinden. In diesem Zusammenhang durchgeführte Mutagenesen des proHJ Promotors ergaben Stämme, die eine Überproduktion von Prolin aufwiesen. Trotz des höheren intrazellulären Prolingehaltes zeigen diese Stämme gegenüber dem Wildtyp keinen Wachstumsvorteil unter Hypersalinität, sind aber weniger sensitiv gegenüber dem toxischen Prolinanalogon 3,4 Dehydro- DL- Prolin. Analysen des ebenfalls prolinakkumulierenden Bakteriums Bacillus licheniformis offenbarten eine große Ähnlichkeit zur Organisation der Prolinsynthesegene in B. subtilis. Das in B. subtilis gefundene regulatorische proHJ-Minimalfragment ließ sich ebenfalls in B. licheniformis identifizieren. Es konnte nachgewiesen werden, dass es auch in B. licheniformis in der Lage ist, die osmotische Regulation der Transkription zu vermitteln. Weitere Analysen zeigten, dass es dieses Fragment auch in B. amyloliquefaciens, B. mojavensis und B. vallismortis gibt. Eine Untersuchung der Auswirkung bekannter oder vermuteter Transkriptionsregulatoren aus B. subtilis konnte kein trans-aktives Regulationssystem identifizieren, das die osmotische Induktion von proHJ vermittelt. Die Aminosäure Glutamat ist als Osmo- und Thermoprotektivum in B. subtilis bekannt (Kerres, 2002; Holtmann und Holtmann et al., 2004). In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Na+/H+/ Symporter GltT aus der Familie der Glutamattransporter die hochaffine Aufnahme von Glutamat sowohl unter Stress- als auch unter Standardkonditionen vermittelt. Proteine der Glutamattransporterfamilie akzeptieren neben Glutamat auch Aspartat als Substrat. GltT konnte neben seiner Rolle als Glutamattransporter ebenfalls als hauptsächlicher Aspartattransporter in B. subtilis identifiziert werden. Die Aminosäure Aspartat konnte in dieser Arbeit erstmalig als Thermo- und Osmoprotektivum in B. subtilis charakterisiert werden. Mit Glutamat und Aspartat konnte zwei proteinogenen Aminosäuren stressprotektive Eigenschaften zugeordnet werden. Um zu untersuchen, ob es sich dabei um eine verbreitete Wirkung von Aminosäuren handelt, wurden alle proteinogenen Aminosäuren auf ihre Protektion von B. subtilis bei Salz-, Hitze- und Kältestress getestet. Die Protektion bei Osmostress wurde durch Aminosäuren vermittelt, die in der Zelle in die Prolinsynthese einfließen können. Thermoprotektive Eigenschaften konnten bei zahlreichen Aminosäuren festgestellt werden, jedoch ist hier der Wirkmechanismus nicht endgültig geklärt. Keine der getesteten Aminosäuren erwies sich als potentes Cryoprotektivum