Biochemische Untersuchungen von Prenyltransferasen aus verschiedenen Ascomyceten

Aspergillus fumigatus ist ein opportunistisch pathogener Schimmelpilz und einer der Hauptauslöser invasiver Aspergillose. Zusätzlich stellt er ein wichtiges Allergen dar. Obwohl die Pathogenität dieses Pilzes von großer Bedeutung ist, ist bis jetzt noch relativ wenig über die Grundlagen dieser Pathogenität bekannt. A. fumigatus produziert eine Vielzahl von Sekundärmetaboliten, die möglicherweise für die Pathogenität mitverantwortlich sind. U. a. bildet dieser Pilz das Epipolythiodioxopiperazin Gliotoxin, das auf Zellkulturen toxisch wirkt. Aus diesem Grund wurde spekuliert, dass Gliotoxin an der Pathogenität beteiligt sein könnte. Es kann aber nicht ausgeschlossen werden, dass noch weiterer Sekundärmetbolite einen Einfluss auf die Pathogenität von A. fumigatus haben. Es ist somit von großem Interesse, mehr über die genetischen Informationen und die Biosynthese von Sekundärmetaboliten, die eventuell als Virulenzfaktoren fungieren könnten, zu erfahren. Das Gencluster der Gliotoxinbiosynthese aus A. fumigatus ist bekannt und besteht aus insgesamt acht Genen. Aus der Genomsequenz von A. fumigatus Af293 konnte ein weiteres Cluster, das drei Gene mit signifikanten Sequenzähnlichkeiten sowohl zu gliC, gliP und gliM aus dem Gliotoxin- als auch zu sirC, sirP und sirM aus dem Sirodesminbiosynthesecluster enthält, identifiziert werden. Sirodesmin ist ein weiteres Epipolythiodioxopiperazin und wird von Leptosphaeria maculans gebildet. Sirodesmin spielt in der Phytopathogenität dieses Pilzes eine entscheidene Rolle. Das putative Gencluster aus A. fumigatus enthält insgesamt acht open reading frames, das Endprodukt des Clusters ist noch unbekannt. Neben den drei schon erwähnten Genen enthält dieses Cluster ein Gen, Afu3g12930, das für eine putative Prenyltransferase kodiert. Die kodierende Sequenz dieses Gens wurde kloniert und in Escherichia coli überexprimiert. Das Protein (7-DMATS) wurde anschließend als His6-Fusionsprotein aufgereinigt. Untersuchungen zur Substratspezifität zeigten, dass 7-DMATS eine breite Akzeptanz besaß und verschiedene aromatische Substrate prenylierte. L-Tryptophan wurde bei diesen Versuchen als Substrat mit der höchsten Umsetzungsrate akzeptiert. Dies war ein Indiz dafür, dass es sich bei dieser Prenyltransferase um eine Dimethylallyltryptophansynthase handelt. Durch Strukturaufklärung des enzymatischen Produktes konnte die Position C-7 des Indolrings eindeutig als Ort der Prenylierung nachgewiesen werden. Wie bereits erwähnt akzeptierte 7-DMATS unterschiedliche aromatische Substrate. Von den getesteten 24 Indolderivaten wurden, bis auf eine Ausnahme im Falle des 7-Methyltryptophans, alle Indolderivate von 7-DMATS akzeptiert und in ihre prenylierten Produkte umgewandelt. Strukturanalysen dieser prenylierten Indolderivate zeigte die Regiospezifität der Prenylierung. In allen Fällen katalysierte 7-DMATS die Anhängung des Prenylrestes an Position C-7 des Indolrings. Durch Optimierung der Reaktionsbedingungen konnte mit acht unterschiedlichen Indolderivaten Umsetzungsraten von 56 bis nahezu 100 % erreicht werden. Basierend auf der breiten Substratspezifität und auf den hohen Umsetzungsraten kann 7-DMATS als ein sehr gutes Werkzeug für eine chemoenzymatische Synthese von prenylierten Indolderivaten angesehen werden