Multiple approaches to determine ASD genetic factors

O transtorno do espectro autista (ASD, do inglês, autism spectrum disorder) é uma condição neuropsiquiátrica de início precoce, caracterizado por déficit do uso da comunicação para socialização e padrões de comportamentos restritos e repetitivos. A herdabilidade do ASD tem sido estimada em 50-90%. O ASD pode se apresentar como uma condição sindrômica, considerando, nesses casos, síndromes genéticas, como a distrofia muscular de Duchenne (DMD), e como uma condição não sindrômica. Além disso, o ASD apresenta uma grande heterogeneidade genética e centenas de genes têm sido relatados como candidatos. As variantes com alta patogenicidade para o ASD são mais comumente raras, de novo e levam ao truncamento da proteína. A função da maioria dos genes candidatos para o ASD ainda é desconhecida e pode explorá-la pode trazer grande conhecimento sobre essa condição. O estudo genômico de casos familiais de ASD pode facilitar a identificação de fatores genéticos possivelmente patogênicos para o ASD, uma vez que esses casos podem estar enriquecidos de fatores genéticos e têm sido pouco explorados. Então, uma estratégia para identificar e validar genes candidatos para o ASD é investigar variantes que levam ao truncamento das proteínas nos casos familiais de ASD. Além disso, entender as alterações dos processos moleculares e celulares desregulados pelos genes candidatos para o ASD pode nos ajudar a compreender melhor a relevância desses genes na manutenção da homeostasia do sistema nervoso central e, também, como esses genes podem causar o fenótipo do ASD. Dessa forma, primeiramente, nós investigamos variantes exômicas raras de perda de função (rLoF, do inglês, rare loss-of-function) (MAF<0,01) potencialmente patogênicas compartilhadas e não compartilhadas por indivíduos aparentados afetados pelo ASD em 13 famílias não relacionadas. Ademais, analisamos se outras variantes rLoF poderiam contribuir para o ASD em dois irmãos que também são afetados por DMD. A partir disso, identificamos 56 variantes rLoF em 54 genes, as quais foram compartilhadas (12 variantes em 11 genes) e não compartilhadas (44 variantes em 43 genes) entre os indivíduos afetados das famílias. Desse total de 54 genes, foi possível destacar 16 genes como principais causas do ASD, nos quais as mutações observadas foram tanto herdadas quanto de novo. Nos indivíduos com ASD/DMD, detectamos uma deleção no gene da distrofina, a qual explica o fenótipo de DMD, e outras duas variantes possivelmente patogênicas no DPYSL4 e no OPALIN que podem contribuir para o ASD. Em uma das famílias estudadas, identificamos mutações bialélicas de perda de função no TBCK, assim estudamos as células neuronais derivadas de iPSC de um indivíduo com rompimento do TBCK. A compreensão da função desse gene pode auxiliar no entendimento das vias de sinalização e assim na busca de tratamentos para os fenótipos neurológicos. No presente estudos, mostramos que a depleção do TBCK nas células neuronais causa alterações no ciclo e proliferação celular, além de desregulação da via mTOR. O tratamento com a L-leucina, um aminoácido que sinaliza na via mTOR, das células neuronais com diminuição de TBCK resgatou a sinalização da via mTOR, bem como, aumentou a proliferação celular. Assim, os nossos resultados sugerem que a L-leucina pode resgatar os fenótipos causados pela redução da expressão do TBCK, os quais abrem novas perspectivas de tratamento de crianças com mutações nesse gene. Somado a isso, nós exploramos o uso da Drosophila melanogaster para realizar estudos funcionais para outros genes candidatos para o ASD. Nós analisamos a morfologia neuronal nas larvas dessa mosca com expressão reduzida do trp&gamma;, mahjong, dys e crmp, os quais são, respectivamente, os ortólogos dos genes humanos candidatos para o ASD: TRPC6, VPRBP, DMD e DPYSL4 (CRMP3). Nas linhagens com diminuição da expressão do trp?, mahjong, dys e crmp, nós observamos várias alterações morfológicas, tais como, defasciculação axonal e anormalidade no formato do ângulo nos neuritos ipsilaterais-contralaterais. Assim sendo, este trabalho evidenciou a heterogeneidade genética do ASD em famílias brasileiras, permitiu a validação e identificação de genes candidatos adicionais para o ASD, contribuiu para a melhor compreensão do papel de alguns genes, em particular, o TBCK, e para o estabelecimento do uso da D. melanogaster para estudar os genes candidatos para o ASD no nosso laboratórioAutism Spectrum Disorder (ASD) is a neuropsychiatric condition of early onset, characterized by deficit in social communication and repetitive and restrict behavior. Its heritability has been estimated between 50-90%. The ASD cases can be related to both syndromic conditions, considering, in these cases, genetic syndromes like Duchenne muscular dystrophy (DMD), and non-syndromic conditions. Moreover, this disorder presents high genetic heterogeneity, and several hundreds of genes have reported as candidates. Variants associated with high pathogenicity in ASD are most usually rare, de novo and lead to protein truncation. The role of most of the ASD candidate genes is still under unclear and explore it could bring important knowledge about this condition. The genomic study of familial cases of ASD could aid the identification of likely pathogenic genetic factors, as it might be enriched by genetic factors and have not been largely explored. Therefore, a potential approach to validate and identify additional ASD candidate variants would be to investigate if truncating variants would explain the ASD phenotype in familial cases. Besides, understanding the molecular and cellular process altered by ASD candidate genes could clarify the relevance of these genes on keeping central nervous system homeostasis as well as how the deficiency of these genes would cause the ASD phenotype. Thus, firstly, we investigated rare loss-of function (rLoF) variants (MAF