Study of the relative frequency and participation of cancer stem cells subpopulations in the process of metastasis of oral squamous cell carcinoma

A presença de metástase em linfonodos cervicais é o fator prognóstico mais importante para o carcinoma epidermóide de boca (CEB), uma das neoplasias malignas mais comuns da região de cabeça e pescoço. Estudos têm associado os mecanismos de progressão tumoral, recorrência e metástase com a presença e manutenção de células-tronco de câncer (CSC, do inglês cancer stem cells), que correspondem à subpopulação celular mais migratória e altamente metastática quando comparada com outras subpopulações presentes no tumor. Ainda, evidências recentes mostram que há uma ligação entre as CSC e o processo de transição epitélio-mesenquimal (EMT, do inglês epithelial-mesenchymal transition), evento em que as células perdem a polaridade e a aderência célula-célula e exibem uma morfologia mesenquimal, o que as permite migrar além do tumor primário. Portanto, o objetivo deste estudo foi de avaliar, in vitro, a associação das propriedades biológicas relacionadas ao fenótipo tronco tumoral e de transição epitélio-mesenquimal, com o comportamento invasivo e metastático das linhagens SCC-9 de CEB primário e metastático correspondente. Para este fim, linhagens celulares parental (SCC-9 ZsGreen) e metastática (SCC-9 ZsGreen LN-1), obtidas após ensaios de tumorigênese in vivo, foram caracterizadas em relação à capacidade de proliferação e migração, bem como à presença e proporção da subpopulação de CSC, baseado na capacidade de formação de colônias tumorais, preferencialmente holoclones, e de esferas tumorais. Ensaios de expressão gênica (qRT-PCR) também foram conduzidos para se verificar os níveis de expressão diferencial dos marcadores de CSC (CD44, BMI1, ALDH1 e p75NTR), bem como de EMT (SNAIL1, TWIST1, AXL, vimentina, E-caderina e N-caderina) em ambas as linhagens tumorais, utilizando-se células epiteliais de palato humano (CEPH) como controle. Tanto a capacidade de proliferação e migração celular, quanto a quantidade de holoclones e esferas tumorais, foram significativamente maiores na linhagem metastática quando comparada com a parental. A linhagem metastática SCC-9 ZsGreen LN1 exibiu, ainda, superexpressão estatisticamente significante de CD44, BMI-1, AXL, vimentina e N-caderina e baixa expressão de E-caderina, quando comparadas com a linhagem parental. O potencial metastático de SCC-9 ZsGreen LN-1 parece ser uma consequência da sua maior quantidade de subpopulação com fenótipo de CSC que, ainda, passou pelo processo de EMT. Portanto, sugere-se que as propriedades biológicas relacionadas à capacidade metastática da linhagem SCC-9 ZsGreen LN-1 parecem estar relacionadas a ambos os fenótipos tronco tumoral e de transição epitélio-mesenquimal.The presence of metastasis in cervical lymph nodes is the most significant prognostic factor for the oral squamous cell carcinoma (OSCC), one of the most common malignant neoplasms of the head and neck. Studies have associated the mechanisms of tumor progression, recurrence and metastasis with the presence and maintenance of cancer stem cells (CSC), which correspond to the most migratory and highly metastatic cellular subpopulation when compared to other cell subpopulations within the tumor. Moreover, recent evidence shows that there is a link between the CSC and the process of epithelial-mesenchymal transition (EMT), an event in which the cells lose their polarity and cell-cell adhesion and exhibit a mesenchymal morphology, which allows them to migrate beyond the primary tumor. Thus, the purpose of the present study was to evaluate, in vitro, the combination of the biological properties related to CSC and EMT phenotypes with the invasive and metastatic behavior of the corresponding primary and metastatic OSCC SCC-9 cell line. For this, parental (SCC-9 ZsGreen) and metastatic (SCC-9 ZsGreen LN-1) OSCC cell lines, obtained after in vivo tumorigenesis assays were characterized regarding the ability of proliferation and migration, as well as the presence and proportion of CSC subpopulation, based on the capacity of generating tumor colonies, preferably holoclones, and tumor spheres. Gene expression assays (qRTPCR) were also conducted to verify the differential expression levels of CSC markers (CD44, BMI-1, ALDH-1 and p75NTR) and EMT (SNAIL1, TWIST1, AXL, vimentin, Ecadherin and N-cadherin) markers in both tumor cell lines, using human palate epithelial cells (HPEC) as control. Both proliferation and cell migration capacity, as well as the numbers of holoclones and tumor spheres were significantly higher in metastatic cell line compared to the parental. Furthermore, the metastatic cell line SCC-9 ZsGreen LN-1 showed significantly higher expression of CD44, BMI-1, ALDH- 1, vimentin, and N-cadherin and lower expression of E-cadherin, when compared to parental cell line. The metastatic potential of SCC-9 ZsGreen LN-1 seems to be a consequence of the greater amount subpopulation with CSC phenotype that also underwent the EMT process. Therefore, it is suggested that the biological properties related to metastatic ability of SCC-9 ZsGreen LN-1 cell line are related to both CSC and EMT phenotypes