Analytical methodology development for a determination of drugs in human plasma used in hypercholestherolemy

Um dos principais fatores de risco de doenças cardiovasculares, a hipercolesterolemia afeta um quinto da população brasileira, e é atualmente a principal causa de morte no Brasil e segunda maior de internações hospitalares, segundo a Sociedade Brasileira de Cardiologia. São utilizados agentes hipolipemiantes nos pacientes com propensão a doenças cardiovasculares associadas. A sinvastatina pertencente a classe dos inibidores da HMG-CoA redutase (3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A) e o ezetimiba pertencente a classe dos inibidores da absorção do colesterol são fármacos hipolipemiantes. Este trabalho possui como objetivo o desenvolvimento e a validação de métodos bioanalíticos através da cromatografia liquida de alta eficiência acoplada ao detector de espectrometria de massas para a determinação simultânea quantitativa de ezetimiba e sinvastatina e seus metabólitos em plasma humano. O presente trabalho foi dividido nas seguintes etapas: (i) obtenção das amostras de pacientes provenientes do HU onde foi administrado a associação ezetimiba+sinvastatina, (ii) obtenção dos padrões de ezetimiba, sinvastatina e padrão interno, (iii) caracterização dos fármacos utilizando técnicas de análises térmicas, ressonância magnética nuclear e espectrometria de infra-vermelho, (iv) obtenção dos padrões dos metabólitos de ezetimiba (ezetimiba glucoronideo) e sinvastatina (sinvastatina hydroxy acid ammonium salt), (v) seleção do método analítico, fase móvel e tipo de extração nas amostras de plasma compatível com o detector de espectrometria de massas e (vi) teste no cromatógrafo líquido de alta eficiência acoplado ao detector de espectrômetro de massas. A separação cromatográfica foi realizada utilizando coluna Poroshell 50mm x 2,1mm, com partícula de 1,8 µm, eluição isocrática usando ácido fórmico 0,1%: acetonitrila (50:50, v/v), vazão 0,7 mL/min e volume de injeção de 10 µL. A temperatura da coluna foi de 30ºC e a detecção foi realizada em equipamento do tipo QTOF, usando fonte ESI no modo positivo para o ezetimiba e sinvastatina e modo negativo para o ezetimiba glucoronideo e sinvastatttina hidroxi-ácida. A monitoração dos íons produto foram: ezetimiba (m/z 409,1489>392,3123), sinvastatina (m/z 418,2719>419,2892), ezetimiba glucoronídeo (m/z 585,1810>521,0673) e sinvastatina hidroxi-ácida (m/z 453,3090>239,0501). Os métodos analíticos foram validados de acordo com os requerimentos vigentes da ANVISA e Farmacopéia Americana. Portanto, os métodos propostos demonstraram ser lineares, precisos, exatos e adequados para a quantificação simultânea de ezetimbe e sinvastatina e seus metabólitos (ezetimiba glucoronídeo e sinvastatina hidroxi-ácida) em plasma humanoOne of the main risk factor, hypercholesterolemia which affects a fifth of the Brazilian people, particularly in people with more than 45 years old and currently is the main cause of death in Brazil and the second one of hospital admissions, according to the Brazilian Cardiology Society. It must be used lipid-lowering agents in patients with trend to cardiovascular disease associated. Simvastatin belongs to the HMG-CoA Reductase Inhibitors class ((3-hydroxy-3-metilglutaril-coenzyme A) and ezetimiba belongs to cholesterol absorption inhibitors and they are hypolipidemic. The aim of this work is to develop and validate Bioanalytical methodology using high performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry (QTOF) to determinate simultaneously quantity of ezetimiba and simvastatin and their metabolites in human plasma. This study was divided into the following steps: (i) obtaining samples of patients from HU where ezetimibe+sinvastatina were administered, (ii) obtaining of ezetimibe, simvastatin and 4-methoxycoumarin (used as internal standard) standards, (iii) charactherization of drugs using techniques of termal analysis, nuclear magnetic ressonance and infra-red spectroscopy, (iv) obtaining of ezetimibe metabolite standard (glucuronide ezetimibe) and simvastatin metabolite standard (simvastatin hydroxy acid ammonium salt), (v) selection of analytical method, mobile phase and type of drugs extraction in human plasma samples to be used mass spectrometry, (vi) tests in the high efficiency liquid chromatography coupled to charged aerosol detector and mass spectrometry detector. Chromatographic separation was carried out using a Poroshell C18 column 50 mm x 2,1 mm with particle size of 1,8 µm, isocratic elution using 0,1% formic acid: acetonitrile (50:50, v/v), flow rate 0,7 mL/ min and injection volume of 10 µL. The column temperature was set at 30ºC and detection was performed in one equipament like QTOF, using ESI source, positive mode. Monitoring of the product ions were: ezetimibe (m/z 410,1557), simvastatina (m/z 419,2784), ezetimibe glucoronídeo (m/z 611,5756) and simvastatina hidroxi-ácida (m/z 552,2250). Analytical methods were validated according to the current ANVISA and United States Pharmacopoeia guidelines. Therefore, the proposed methods showed evidence to be linear, accurate and precision, suitable to the simultaneous quantitation of ezetimibe and simvastatin and their metabolites (ezetimibe glucoronídeo e sinvastatina hidroxi-ácida) in human plasm