Obtainment and characterization of stem cells from the hair follicle of canine fetuses

O pelo é uma característica dos mamíferos: na maioria das espécies, juntamente com a pele, a pelagem reveste externamente o corpo, com exceção de algumas regiões bem delimitadas. O pelo do cão e demais mamíferos apresenta formato distinto de acordo com a região do corpo. O estudo da obtenção e caracterização de células-tronco em cães poderá ampliar as possibilidades terapêuticas, mediante a utilização das células indiferenciadas na reparação capilar e lesões da pele e seus anexos. Neste trabalho foram utilizadas amostras de folículo piloso retiradas da região rostral de fetos caninos correspondentes a três fases gestacionais distintas (grupo I= 30 dias de gestação; grupo II= 35 dias de gestação; grupo III= 40 dias de gestação).Estas amostras foram cultivadas em placas de Petri de 75 cm² com 5mL de meio de cultivo DMEM, suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e 1% de antibióticos estreptomicina/penicilina. As células obtidas foram congeladas e descongeladas e utilizados nos procedimentos de, análise da expressão dos marcadores de células-tronco: STRO-1, CD 117, OCT 3/4, CD 90, Nanog, CD- 34, SSEA-4, CD -105, MCP-1, HSP- 47, CD 1 A, VEGFR1, DR4, IL- 1 β, caspase3, Ki- 67, CD -45. A escolha dos anticorpos marcadores de células-tronco foi baseada em estudos que mostraram afinidade e avidez com o folículo piloso. Utilizamos também para a caracterização do folículo piloso, a imunohistoquímica e análise de PCR com o marcador S100 e a imunocitoquímica com os marcadores OCT 3/4, VEGF, STRO-1, CD117 e Nanog. Os resultados obtidos sugerem que a linhagem celular do folículo piloso de fetos de cães apresentaram crescimento satisfatório com a utilização do meio DMEM-hight suplementado com 10% de SFB inativado e 1% de antibióticos, sendo mantidas e expandidas em cultivo. O crescimento e a expansão das células-tronco do folículo piloso são peculiares, pois, sua expansão ocorre em torno da haste pilosa, utilizando-a como ancoragem. Os resultados indicaram características de pluripotência nas células-tronco do folículo piloso pela expressão dos marcadores OCT3/4, Nanog, CD105, CD90, SSEA-4, e STRO-1, em todos os grupos analisados. Considerando, a taxa de proliferação, a fase do ciclo celular, distribuição e aspectos de morte celular não foram encontradas diferenças significantes na expressão dos marcadores HSP47, DR4. Para verificar a angiogêneseforam utilizados os marcadores VEGFR1, Ki-67 e caspase-3, sendo expressos em todos os grupos. Na imunohistoquímica e análise de PCR observou-se a expressão da proteína S100, sendo maior nas células do grupo de fetos com 40 dias de gestação- grupo III. Neste estudo, podemos concluir que o conjunto de marcadores expressos nos diferentes grupos de células tronco obtidas das vibrissas de fetos caninos indicaram a expressão de marcadores de pluripotência das células-tronco do folículo pilosoHair is a characteristic of mammals, since in most species the coat spreads throughout the body, except for some well-defined regions. Mammals in general, including dogs, have different characteristics in their coat according to the region of the body. The study of obtainment and characterization of stem cells from the hair follicle could contribute to new therapeutic possibilities, particularly in the treatment of hair, skin and it appendices injuries. In this study, hair follicle samples were harvestedin the rostral region of canine fetuses, divided into three distinct groups, according to the stage of pregnancy, as follows: Group I = 30 days, Group II = 35 days, Group III = 40 days. These samples were grown in 75 cm² Petri dishes with 5 mL of DMEM culture medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and antibiotics 1% streptomycin / penicillin. Cells were frozen and thawed and used in procedures for analysis of expression of markers of stem cells: STRO-1, CD 117, OCT 3/4, CD 90, Nanog, CD- 34,SSEA -4,CD- 105, MCP-1, HSP-47, CD 1 A, VEGF-R1, DR4, IL-1 β, caspase-3, Ki-67, CD -45. The choice of antibodies was based on studies that showed affinity and avidity to the hair follicle. In addition, for purposes of characterization of the hair follicle, procedures for immunohistochemistry and PCR analysis with the marker S100 and immunocytochemistry with the markers OCT3/4, VEGF, STRO-1, CD117 e Nanog were used. The results suggested that hair follicle cell line of fetal dogs showed satisfactory growth using the DMEM high medium supplemented with 10% inactivated FBS and 1% antibiotics and could be maintained and expanded in culture. The growth and expansion of stem cells of the hair follicle are unique because they occur around the hair shaft using it as anchorage. Results also indicated pluripotency features in the hair follicle stem cells through the positive expression of Oct3/4, Nanog, CD105, CD90, SSEA-4 and STRO-1, in all groups. Regarding the proliferation rate and cell cycle phase, distribution and cell death aspects, HSP47, DR4 were used. To verify angiogenesis, VEGFR1, Ki67 and Caspase-3 were expressed in all groups. In Immunohistochemistry procedures we observed the expression of S100, and in mRNA on RT-PCR. We concluded in this study that in group III the expression of S100 was higher than in the two other groups. In addition, we found that the pluripotency of the stem cells was indicated by the expression of the markers OCT3/4, Nanog, CD105, CD90, SSEA-4 and STRO-