Intracellular iron: a modifiable risk factor for cardiovascular susceptibility?

Mutações no gene Hfe causam a forma mais comum da hemocromatose hereditária, doença caracterizada por acúmulo progressivo de ferro nos tecidos parenquimatosos. Um estudo prévio conduzido em nosso laboratório (Am J Cardiol 88(4):388-91, 2001) encontrou associação entre mutação do gene Hfe e cardiomiopatia isquêmica, sugerindo que o acúmulo de ferro no tecido cardíaco pode ser um fator que potencializa as agressões ao sistema cardiovascular. O objetivo do presente trabalho foi testar a hipótese de que o ferro aumenta a susceptibilidade ao risco cardiovascular. A análise de dados de 318 pacientes seguidos durante 10 anos indicou que variantes genéticas do Hfe estão associadas com maior mortalidade em pacientes com insuficiência cardíaca de diferentes etiologias. Em seguida, verificou-se o acúmulo de ferro no coração, aorta e fígado ao longo de 1, 3, 6 e 12 meses em camundongos FVB. Para mimetizar os efeitos deletérios do ferro no ser humano, validamos proteínas envolvidas no metabolismo do ferro em camundongos e tratamos os animais com 10 mg diárias de ferro dextrano durante 4 semanas. Os resultados sem a sobrecarga de ferro já apontaram acúmulo de ferro significativo no coração e no fígado ao longo de 12 meses de vida, consistente com a ideia de aumento progressivo de risco cardiovascular associado ao envelhecimento. A sobrecarga de ferro foi associada com maior mortalidade e deterioração da função cardíaca. Os camundongos tratados com ferro apresentaram diminuição da fração de ejeção, redução da espessura do septo, maior remodelamento cardíaco e aumento do volume nuclear dos cardiomiócitos. Para entender as modulações gênicas causadas pelo ferro no coração, foi medida a expressão dos transcritos primários de mRNA relativo para os genes Hfe e para a hepcidina, encontrando-se ambos os genes significativamente menos expressos nos animais tratados com ferro em comparação ao grupo que só recebeu salina. Por fim, com o intuito de estudar em condições mais controladas o comportamento cardíaco frente à sobrecarga de ferro, foram comparados dois protocolos de extração primária de cardiomiócitos ventriculares de ratos neonatos para testes farmacológicos com ferro in vitro. O enriquecimento de cardiomiócitos in vitro se estabeleceu por dois métodos: separação por gradiente de percoll (Per) e por uma pré-seleção nomeada pre plating (PP). As células cardíacas foram mantidas por 8 dias em cultura e avaliações do metabolismo, produção de espécies reativas de oxigênio e contratilidade foram medidas. Ambos os métodos foram eficientes para a obtenção de células cardíacas, entretanto, as células extraídas por protocolo PP apresentaram metabolismo aumentado, com maior consumo de glicose e produção de lactato. Por diferentes parâmetros testados o protocolo PP apresentou maior estresse oxidativo, porém sem modular a quantidade de glutationas reduzidas e oxidadas. Notadamente, o protocolo PP apresentou maior atividade contrátil com aumento dos batimentos e maior influxo intracelular de cálcio. Células cardíacas extraídas pelo método PP foram tratadas com citrato de amônia férrico com doses de 50 ?g/mL e 100 ?g/mL e, após 24 horas, foi possível observar aumento significativo de apoptose. Desta forma, os modelos celulares em questão apresentam-se como importantes ferramentas para a identificação de mecanismos moleculares e celulares associados aos efeitos deletérios causados pelo ferro. Em conjunto, os resultados do presente trabalho apoiam a hipótese de que o acúmulo de ferro no tecido cardíaco aumenta a susceptibilidade cardiovascular. Trabalhos futuros permitirão melhor compreensão dos mecanismos envolvidos no acúmulo de ferro no coração ao longo do envelhecimento em pacientes com insuficiência cardíacaMutations in Hfe gene lead to the most common form of hereditary hemochromatosis, an autosomal recessive disease associated with iron accumulation in parenchymal tissues. In a previous study conducted in our laboratory (Am J Cardiol 88(4):388-91, 2001), genetic variation in the Hfe gene was associated with ischemic cardiomyopathy, suggesting that higher cardiac concentrations of iron aggravates injuries on the cardiovascular system. The aim of the present study was to test the hypothesis that iron increases susceptibility to cardiovascular risk. Analysis of data from 318 patients with 10-year follow-up showed that genetic variation in the Hfe gene was associated with higher mortality among patients with heart failure due to cardiomyopathy of different etiologies. Next, we demonstrated iron accumulation in heart, aorta, and liver in mice (FVB background) aged 1, 3, 6, and 12 months. To mimic the deleterious effect of iron observed in humans, we validated proteins playing a major role in iron metabolism and treated mice with 10 mg of iron-dextran daily for 4 weeks. Results showed that even without iron overload there is significant iron accumulation in the heart and liver with time, at 12 months of age, consistent with the idea that there is a progressive age-related increase in cardiovascular risk. Iron overload was associated with higher mortality in mice and impairment of cardiac function; in response to iron treatment ejection fraction and septum thickness were reduced, while cardiac remodeling and myocyte nuclear volume were increased. To understand the underlying mechanisms associated with iron-mediated modulation of genes in the heart, we assessed Hfe and hepcidin mRNA expression and found that these genes were significantly less expressed in iron-treated animals compared with the saline solution group. Lastly, to study cardiac behavior in the face of iron overload under well-controlled conditions we compared two protocols for primary extraction of neonatal rat cardiomyocytes for in vitro pharmacological tests: Percoll (Per) and pre plating (PP) extraction methods. Cardiac cells were used after 8 days and we measured metabolism, ROS production, and contractility. Both methods were effective in obtaining a high yield of cardiomyocytes. Nevertheless, cells extracted using PP protocol presented higher metabolic rate, as suggested by increased lactate production and glycolysis rate. In the PP protocol there was an increased oxidative stress, notwithstanding without modulating the amount of oxidized and reduced glutathione peroxidase. Notably, we found an increased contractile activity for pre-platting-prepared cells, with increased beating rate and higher calcium influx. Cardiac cells extracted by PP exposed to ferric ammonium citrate with doses of 50?g/mL and 100?g/mL, after 24 hours, displayed significant increased apoptosis. The cell models examined can be considered important tools for the identification of cell and molecular mechanisms associated with the harmful effects caused by iron. Taken together, the results of the present study support the hypothesis that cardiac tissue iron accumulation increases cardiovascular susceptibility. Further studies will help to unravel the mechanisms involved in cardiac iron accumulation throughout the aging process in patients with heart failur