Epigenetic studies in crack and cocaine dependents: investigation of global genome methylation

INTRODUÇÃO: A expansão e disseminação do consumo de crack e cocaína no Brasil vem se tornando um grave problema de saúde pública nos últimos vinte anos. Diferentes abordagens biológicas têm sido investigadas utilizando o fenótipo de abuso/dependência de crack/cocaína, cujos resultados têm demonstrado a participação importante do substrato genético, assim como a sua interação com os fatores ambientais no desenvolvimento desse transtorno. OBJETIVOS: Investigar o padrão de metilação do DNA do genoma de indivíduos que apresentam abuso/dependência de cocaína e de crack, comparando ao padrão de metilação de indivíduos controles. MÉTODOS: Foram selecionados 24 dependentes de cocaína e crack e 24 controles saudáveis, pareados por sexo e idade. Utilizando amostras de DNA extraídas de sangue periférico de cada um dos participantes, foi realizada a técnica de metilação global com o ensaio Illumina Infinium Human Methylation450 (450K) BeadChip. Os resultados iniciais foram normalizados considerando a heterogeneidade celular e analisados utilizando o pacote ChAMP (Chip Analysis Methylation Pipeline) para identificar genes e/ou regiões gênicas diferencialmente metiladas que possam representar fatores de vulnerabilidade para o comportamento de abuso/dependência do crack e da cocaína. Os processos biológicos e vias celulares com os quais os sítios diferencialmente metilados estão envolvidos foram explorados usando as ferramentas disponibilizadas pelo \"WebGestalt\" e pelo \"UCSC Genome Browser\". RESULTADOS: Foram observados 250 sítios diferencialmente metilados, associados a 246 genes na comparação dos perfis de metilação entre os casos e controles, sendo que 49% destes estavam localizados nas regiões promotoras dos genes, sugerindo que esses sítios podem estar relacionados com a expressão gênica. Alterações estatisticamente significantes no padrão de metilação entre casos x controles foram observadas em 23 sítios CpG (p-valor ajustado < 10-5 e |?beta| = 0,1). Observou-se também que três regiões diferencialmente metiladas foram associadas a genes hipometilados (BMP8A, GPR88 e RNF166) (p-valor ajustado < 0.05), cada uma com pelo menos três sítios. Alterações estatisticamente significantes também foram observadas em seis genes hiper-representados: CALCA, NCOA2, DRD2, EHMT1, EHMT2, MAP2K1, MAPK3 e MAPK1, envolvidos em processos biológicos e moleculares. CONCLUSÕES: Observou-se diferenças estatisticamente significativas no padrão de metilação genômico de usuários/dependentes de crack e cocaína quando comparados aos controles saudáveis em amostra de DNA extraídas de sangue periférico. Comparação de estudos de expressão em tecido cerebral correlacionaram-se parcialmente com os achados apresentados. Outros estudos utilizando amostras independentes são necessários para confirmar esses achados. A confirmação desses resultados poderá contribuir na identificação e compreensão dos mecanismos biológicos envolvidos na dependência do crack/cocaínaBACKGROUND: The expansion and dissemination of crack and cocaine in Brazil has become a progressive and serious public health problem during the last twenty years. Different biological approaches have been investigated using the crack/cocaine abuser/dependent phenotype, with results confirming the important role of the genetic component, as well as its interaction with environmental factors. OBJECTIVES: To investigate the DNA methylation pattern levels in the genome of individuals with crack and cocaine abuse/dependence and comparing it with the DNA methylation pattern of the genome of control subjects. METHODS: 24 crack and cocaine abusers/dependents and 24 healthy controls were selected and matched by sex and age. Using DNA samples from peripheral blood of each participant, a global methylation technique was performed using the Illumina Infinium Human Methylation450 (450K) Bead Chip assay. The initial results were normalized for cellular heterogeneity and re-analyzed using ChAMP package (Chip Methylation Analysis Pipeline) to identify differentially methylated genes or/and DNA regions that may represent biological/genetic risk factors for crack and cocaine abuse/dependence behavior. The biological processes and cellular pathways were explored using tools provided by \"WebGestalt\" and \"UCSC Genome Browser\". RESULTS: 250 differentially methylated sites associated with 246 genes in methylation comparison profiles between cases and controls were identified, of which almost half were located in the promoter regions of genes (49%), suggesting that these sites may be related to gene expression. Statistically significant changes in the methylation patterns between cases and controls were observed in 23 CpG sites (adjust p-value < 10-5 and |deltabeta| = 0.1). In addition, three differentially methylated regions were associated with hipomethylated genes (BMP8A, GPR88 e RNF166) (adjust p-value < 0.05), each one with at least three sites. Statistically significant changes were also observe with six hiper-represented genes: CALCA, NCOA2, DRD2, EHMT1, EHMT2, MAP2K1, MAPK3 e MAPK1, which are involved in biological and molecular processes. CONCLUSIONS: Crack and cocaine users/dependents presented significant statistical differences in the methylation pattern when compared to healthy controls in DNA samples extracted from peripheral blood. Results from gene expression studies using brain tissue can be correlated with our results. In order to confirm the present findings, future studies should be replicated using independent samples. The confirmation of these results will contribute to the understanding of the biological mechanisms involved in crack/cocaine dependenc