Development of methods for liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry for drug analysis (LC-MS/MS in column switching mode with monolithic capillary hybrid silica), amino acids and neurotransmitters (HILIC-MS/MS) in plasma samples of schizophrenic patients.

A esquizofrenia é um transtorno neuropsiquiátrico crônico que afeta aproximadamente 1% da população mundial. As teorias neurobiológicas descrevem que a esquizofrenia é essencialmente causada por alterações bioquímicas e estruturais do cérebro, devido às disfunções nos sistemas glutamatérgico, dopaminérgico e serotoninérgico. Desta forma, a determinação das concentrações de aminoácidos e neurotransmissores em amostras de plasma de pacientes esquizofrênicos pode auxiliar na avaliação da eficácia da terapia. Além dos antipsicóticos, medicação de primeira linha no tratamento inicial da esquizofrenia, a maioria dos pacientes também faz uso concomitante de outras classes de fármacos, tais como antidepressivos, anticonvulsivantes e ansiolíticos para minimizar os sintomas associados a esta doença. Nesta tese, um método empregando a precipitação de proteínas (PPT) e a cromatografia líquida por interação hidrofílica acoplada à espectrometria de massas em tandem (HILIC-MS/MS) foi adequadamente desenvolvido e validado para a determinação de aminoácidos (aspartato, serina, glicina, alanina, metionina, leucina, tirosina e triptofano) e neurotransmissores (glutamato e ácido -aminobutírico) em amostras de plasma de 35 pacientes esquizofrênicos em tratamento com clozapina (27 pacientes) e olanzapina (8 pacientes) para avaliar a eficácia do tratamento, tendo como controle 38 voluntários sadios. O método HILIC-MS/MS apresentou linearidade do LIQ (9,7 pmol mL-1 - 13,3 nmol mL-1) ao LSQ (19,4 nmol mL-1 - 800 nmol mL-1), tempo de análise de 3,0 min, exatidão com EPR de -18 a 19% e precisão com CV de 0,1 a 16% (LIQ). A análise de variância (ANOVA), seguida por teste post-hoc de Duncan, revelou que os níveis médios plasmáticos (nmol mL-1) de metionina (F2,70 = 3,14, p = 0,049) de pacientes esquizofrênicos em tratamento com olanzapina foram significativamente mais elevados, quando comparados aos valores obtidos com o grupo controle (voluntários saudáveis), já o nível de glutamato em pacientes esquizofrênicos em tratamento com clozapina apresentaram tendência a valores mais altos (F2.70 = 2,50, p = 0,090). Já os métodos, PPT/LC-MS/MS e LC-MS/MS no modo column switching utilizando uma coluna monolítica de sílica híbrida com grupos cianopropil na primeira dimensão, foram desenvolvidos e validados para a determinação dos antipsicóticos (olanzapina, quetiapina, clozapina, haloperidol e clorpromazina), antidepressivos (mirtazapina, paroxetina, citalopram, sertralina, imipramina, clomipramina e fluoxetina), anticonvulsivantes (carbamazepina e lamotrigina), e ansiolíticos (diazepam e clonazepam) em amostras de plasma de pacientes esquizofrênicos para fins de monitorização terapêutica. O método PPT/LC-MS/MS apresentou linearidade do LIQ (0,2 ng mL-1 - 5,0 ng mL-1) ao LSQ (40,5 ng mL-1 - 10,5 g mL-1), exatidão com EPR de -9,7 a 8,0%, e precisão com CV de 0,1 a 12%. Já o método LC-MS/MS no modo column switching apresentou linearidade do LIQ (63,0 pg mL-1 - 1250,0 pg mL-1) ao LSQ (40,5 ng mL-1 - 10,5 g mL-1), exatidão com EPR de -14 a 12% e precisão com CV de 0,6 a 6,5%. A pré-concentração seletiva dos fármacos na coluna monolítica com grupos cianopropil incorporados e a remoção dos componentes endógenos da amostra biológica, antes da separação cromatográfica, favoreceram a seletividade e detectabilidade do método LC-MS/MS no modo column switching. Este método quando comparado ao de referência PPT/LC-MS/MS, através da análise de 10 amostras de pacientes esquizofrênicos, não apresentou diferença significativa (teste t) entre as concentrações plasmáticas, podendo ser aplicado na monitorização terapêutica. Além deste fato, este método automatizado favoreceu a precisão, a exatidão e a freqüência analítica.Schizophrenia is a chronic neuropsychiatric disorder that affects approximately 1% of the world population. According to neurobiological theories, schizophrenia stems from biochemical and structural alterations in the brain due to dysfunction in the glutamatergic, dopaminergic, and serotonergic systems. Determining the concentrations of amino acids and neurotransmitters in plasma samples from schizophrenic patients may assist evaluation of therapy effectiveness. In addition to antipsychotics (the first-line drug in the initial treatment of schizophrenia), most patients concomitantly use other classes of drugs such as antidepressants, anticonvulsants, and anxiolytics to minimize the symptoms associated with this disease. To evaluate treatment efficacy, in this thesis a method based on protein precipitation (PPT) and hydrophilic interaction liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HILIC-MS/MS) has been properly developed and validated to determine amino acids (aspartate, serine, glycine, alanine, methionine, leucine, tyrosine, and tryptophan) and neurotransmitters (glutamate and -aminobutyric acid) in plasma samples obtained from 35 schizophrenia patients treated with clozapine (27 patients) or olanzapine (8 patients); 38 healthy volunteers served as controls. The HILIC-MS/MS method was linear for concentrations ranging from the LLOQ (9.7 pmol mL-1 - 13.3 nmol mL-1) to the ULOQ (19.4 nmol mL-1 - 800 nmol mL-1). The analysis time was 3.0 min. In the case of accuracy, RSE ranged from -18 to 19%. As for precision, CV lay between 0.1 and 16% (LLOQ). Analysis of variance (ANOVA) followed by post-hoc Duncan showed that the average methionine serum levels (nmol mL-1) (F2.70 = 3.14, p = 0.049) in schizophrenic patients treated with olanzapine were significantly higher as compared with the control group (healthy volunteers). The glutamate level in schizophrenic patients treated with clozapine tended to higher values (F2.70 = 2.50, p = 0.090). Concerning the analytical methods, PPT/LC-MS/MS and LC-MS/MS operating in the column-switching mode were developed and validated to determine antipsychotic (olanzapine, quetiapine, clozapine, haloperidol, and chlorpromazine), antidepressants (mirtazapine, paroxetine, citalopram, sertraline, imipramine, clomipramine, and fluoxetine), anticonvulsants (carbamazepine and lamotrigine), and anxiolytics (diazepam and clonazepam) in plasma samples taken from schizophrenic patients for therapeutic drug monitoring. A monolithic hybrid column containing silica with cyanopropyl groups in the first dimension was employed. The PPT/LC-MS/MS method was linear from the LLOQ (0.2 ng mL-1 - 5.0 ng mL-1) to the ULOQ (40.5 ng mL-1 - 10.5 g mL-1). In the case of accuracy, RSE ranged from -9.7 to 8.0%; as for precision, CV lay between 0.1 and 12%. LC-MS/MS in the column-switching mode was linear from the LLOQ (63.0 pg mL-1 - 1250.0 pg mL-1) to the ULOQ (40.5 ng mL-1 - 10.5 g mL-1). RSE ranged from -14 to 12%; CV lay between 0.6 and 6.5%. The drugs were selectively pre-concentrated in the monolithic column containing silica incorporated with cyanopropyl groups. For the LC-MS/MS method operating in the column-switching mode, the endogenous components of the biological sample of the LC-MS/MS method were removed before analysis. Analysis of 10 plasma samples obtained from schizophrenic patients did not reveal any significant differences (t test) between the LC-MS/MS method and the reference PPT/LC-MS/MS method. Therefore, LC-MS/MS can be applied in therapeutic monitoring, with the advantage that this method offers improved precision, accuracy, and analytical frequency