Influence of low frequency ultrasound associated with hydrogels on the skin permeability and in topical skin cancer treatment

O câncer de pele é uma doença com grande incidência mundial. O tratamento tópico do câncer de pele é uma estratégia desejada uma vez que pode diminuir os efeitos adversos graves causados pelo tratamento cirúrgico e quimioterapia sistêmica. No entanto, os tratamentos tópicos atuais são limitados pela baixa efetividade das formulações em carrear o fármaco até as camadas mais profundas da pele. Desta forma, o ultrassom de baixa frequência (LFU) apresenta-se como um método atrativo, mas ainda pouco estudado, para aumentar a permeabilidade da pele. Portanto, o objetivo desse trabalho foi estudar modificações na composição dos meios de acoplamento do LFU visando aumentar as regiões de transporte localizadas (LTRs) da pele e a permeabilidade do quimioterápico doxorrubicina (DOX) para o tratamento tópico do câncer de pele. Para isso, um hidrogel de Poloxamer (nanogel) enriquecido com nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) contendo DOX foi preparado e caracterizado; diferentes meios de acoplamento, dentre eles os tradicionais, contendo tensoativo, e os inovadores, contendo as NLS ou hidrogéis com diferentes potenciais zeta e viscosidades semelhantes, foram avaliados associados ao LFU para verificar sua influência na formação das LTRs e penetração cutânea de dois fármacos, calceína e DOX; a penetração cutânea da DOX livre e encapsulada em NLS foi quantificada nas diferentes camadas da pele pré-tratada com LFU; e, finalmente, o pré-tratamento mais promissor, LFU associado ao nanogel, seguido da aplicação passiva da DOX incorporada no nanogel foi avaliada in vivo em tumores cutâneos induzidos em camundongos imunossuprimidos. As NLS apresentaram tamanho e PdI de aproximadamente 200 nm e 0,3 respectivamente, com alto potencial zeta catiônico e pH de 3. A incorporação das NLS no nanogel não alterou o tamanho e PdI, no entanto, diminuiu o potencial zeta da formulação e elevou o pH para 5,5. Verificou-se por difração de raios X a baixo ângulo que as NLS continham fases cristalinas lamelares, enquanto o nanogel, fases cristalinas cúbicas, que foram mantidas quando as formulações foram associadas. O uso das NLS e dos hidrogéis, incluindo o nanogel, como meio de acoplamento do LFU modificou consideravelmente a distribuição e número de LTRs na pele em relação aos meios tradicionais. Tanto o número de LTRs quanto a sua distribuição parecem estar relacionados à tensão interfacial e a viscosidade do meio hidrofílico, sendo que a maior viscosidade dos géis gerou maior área de LTRs. O uso do nanogel originou LTRs em 50% da área da pele tratada, área esta 24 vezes maior do que a área de LTRs formada quando o meio de acoplamento convencional, com lauril sulfato de sódio, foi utilizado. Observou-se que a influência das LTRs na penetração de fármacos aniônicos (calceína) e catiônicos (DOX) depende do potencial zeta do hidrogel usado como meio de acoplamento e da dissociação do fármaco. Desta forma, a permeação cutânea da calceína foi menor quando gel aniônico foi utilizado como meio de acoplamento e o inverso ocorreu para a DOX. A penetração da DOX através do estrato córneo da pele pré-tratada com LFU/nanogel aumentou mais de 4 vezes, mas a encapsulação da DOX nas NLS dificultou a passagem da DOX para as camadas mais profundas da pele após o pré-tratamento da mesma com LFU, sugerindo um recuperação da pele desestruturada pelas partículas lipídicas administradas após o pré-tratamento. Nos estudos in vivo, o pré-tratamento da pele com LFU/nanogel seguido da aplicação diárias do nanogel contendo DOX resultou em diminuição de 6 vezes do volume do tumor após 21 dias de tratamento e apenas 5 aplicações do LFU/nanogel. No entanto, a diminuição do volume do tumor só ocorreu quando a sonda do LFU foi posicionada a 10 mm da superfície do tumor. O posicionamento da sonda a uma distância mais próxima do tumor (5 mm) não diminuiu o tamanho do tumor. Conclui-se que a aplicação de LFU com hidrogéis como meio de acoplamento é uma alternativa simples e efetiva para aumentar a penetração de fármacos na pele. Esta penetração pode ser modulada em função do potencial zeta do meio de acoplamento e da posição da sonda do ultrassom em relação à superfície do tumor. Desta forma, o tratamento tópico do câncer de pele usando LFU/nanogel como pré-tratamento é uma estratégia promissora para o tratamento tópico do câncer de pele.Skin cancer is a disease with high worldwide incidence. Topical treatment of skin cancer is a desired strategy since it can reduce the serious adverse effects caused by surgery and systemic chemotherapy. However, current topical treatments are limited by low effectiveness of the formulations delivery drug to the deeper layers of the skin. Thus, the low frequency ultrasound (LFU) presents itself as an attractive method, but still little studied, to increase skin permeability. Therefore, the objective of this work was to study changes in the LFU coupling medium composition to increase the transport localized region (LTRs) in the skin and the permeability of chemotherapeutic doxorubicin (DOX) for the topical skin cancer treatment. For this, a Poloxamer hydrogel (nanogel) supplemented with solid lipid nanoparticles (SLN) containing DOX was prepared and characterized; different coupling medium, including traditional, containing surfactant, and innovative, containing the NLS or hydrogels with different viscosities and zeta potential similar, were evaluated associated with the LFU to verify its influence in LTRs formation and skin penetration of two drugs, calcein and DOX; skin penetration of free and encapsulated DOX was quantified in the different layers of the LFU pretreated skin; and finally, the most promising pretreatment, LFU associated with nanogel, followed by the passive application of DOX incorporated into the nanogel was evaluated in vivo, in skin tumors induced in immunosuppressed mice. The NLS showed size and PDI of approximately 200 nm and 0.3, respectively, with high cationic zeta potential and pH 3 value. The incorporation of the NLS into the nanogel did not change the size and PDI, however, decreased the zeta potential of the formulation and increased pH value to 5.5. It was found by low angle X-ray diffraction that NLS-containing lamellar crystalline phase while the nanogel, cubic crystalline phases, which were maintained when the formulations were associated. The use of NLS and hydrogels, including nanogel, as coupling medium of LFU substantially modify the distribution and number of the LTRs in the skin compared to traditional medium. Both, LTRs number and distribution may be related to the interfacial tension and viscosity of the hydrophilic medium, hydrogel with higher viscosity produced greater LTRs area. The use of nanogel as coupling medium resulted in LTRs formation in 50% of treated skin area, this area is 24 times larger than the LTR area LTRs formed when conventional coupling medium sodium lauryl sulfate was used. It was observed that the influence of the LTRs in the penetration of anionic drugs (calcein) and cationic (DOX) depends on the zeta potential of the hydrogel used as coupling medium and drug. Thus, the permeation of calcein was lower when anionic gel was used as the coupling medium and the opposite occurred for DOX. DOX penetration through the stratum corneum of the skin pretreated with LFU / nanogel increased more than 4 times but the encapsulation of DOX in the NLS difficult the passage of DOX to the deeper layers of the skin after pre-treatment with LFU, suggesting the recovery of the skin by lipid particles administered after pretreatment. In the in vivo study, pretreatment of the skin with LFU / nanogel followed by the daily application of nanogel containing DOX resulted in a 6-fold decrease in tumor volume after 21 days of treatment with only 5 applications LFU / nanogel. However, the reduction of tumor volume occurred only when the LFU probe was positioned 10 mm from the tumor surface. The positioning of the probe at distance closer tumor (5 mm) has not decreased tumor size. It is concluded that the application of coupling medium hydrogels with LFU is a simple and effective alternative to enhance drug penetration into the skin. This penetration can be adjusted depending on the zeta potential of the coupling means and ultrasound probe position on the tumor surface. Therefore, topical treatment of skin cancer using LFU / nanogel as pre-treatment is a promising strategy for the topical treatment of skin cancer