Bioprospection of brazilian cyanobacteria strains in order to obtain cyanopeptides inhibitors of proteases.

Algumas espécies de cianobactérias podem produzir diferentes tipos de peptídeos bioativos (cianopeptídeos), como aeruginosinas, cianopeptolinas, microgininas, microviridinas, anabaenopeptinas e microcistinas. As microcistinas, que compõem a classe mais conhecida na literatura científica, são hepatotoxinas e inibem fosfatases do tipo 1 e 2A. Já as microgininas, moléculas inibidoras da enzima conversora de angiotensina (ECA) e de outras proteases, são importantes candidatas ao desenvolvimento de fármacos anti-hipertensivos. No entanto, as funções fisiológicas desses compostos ainda não foram completamente elucidadas. O objetivo desse estudo é identificar e isolar cianopeptídeos, especialmente da classe das microgininas, produzidos por cepas de cianobactérias brasileiras. O fracionamento dos extratos das cianobactérias foi biomonitorado por meio de ensaios de inibição da ECA. Para tanto, foram produzidos extratos de culturas de 59 cepas de cianobactérias mantidas em laboratório e, quando pertinente, seguiu-se o pré-fracionamento por extração em fase sólida em coluna de fase reversa. As frações obtidas foram testadas para a inibição da ECA e analisadas por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS). Nos casos em que houve inibição, o fracionamento foi continuado por cromatografia líquida de alta eficiência semipreparativa para o isolamento dos cianopeptídeos. As espécies analisadas pertencem aos gêneros: Microcystis, Oscillatoria, Radiocystis, Sphaerocavum, Sphaerospermopsis, Cylindrospermopsis, Leptolyngbya, Pleurocapsa, Chrooccocidiopsis, Nostoc, Brasilonema, Desmonostoc, Oculatella e Limnothrix. Além de outras espécies das famílias Pseudanabaenaceae, Nostocaceae e Michochaetaceae que não tiveram suas identificações concluídas. Nas análises por HPLC-DAD não foram encontrados picos com espectros de UV característicos de microgininas nas 59 cepas avaliadas. Esses resultados foram corroborados por análises por LC-MS, nas quais também não foi possível a detecção desses compostos. Como método de triagem, as análises por LC-MS triplo quadrupolo foram conduzidas via precursor ion scan para o monitoramento das perdas m/z 128 e 142, que são fragmentos oriundos do aminoáciodo Ahda, exclusivamente presente em microgininas. Algumas linhagens se revelaram produtoras de variantes do cianopeptídeo microcistina, possuindo absorção UV máxima em 238 nm. Amostras de Israel, doadas pelo Prof. Shmuel Carmeli, da Universidade de Tel Aviv, também foram analisadas por espectrometria de massas no modo precursor ion para a investigação da produção de microgininas. Foram encontrados íons de m/z 128 e 142 em uma das amostras de Israel. Ensaios enzimáticos iniciais da ECA foram realizados com frações das cepas controle LTPNA 08 e 09, sabidamente produtoras de microgininas. Realizou-se a otimização do método inicial de detecção dos cianopeptídeos para que fosse procedido o isolamento dos compostos de interesse da cultura LTPNA 08. As frações obtidas foram analisadas por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS) e isoladas por um coletor de frações. 4,8 mg de microgininas foram obtidos com o isolamento das moléculas a partir de 3 g de biomassa seca da linhagem. Ensaios enzimáticos de inibição da ECA com as frações isoladas de microgininas e microcistina-LR comercial também foram realiazados. Os resultados mostram que tanto as microgininas quanto a microcistina-LR comercial apresentam potencial de inibição da enzima ECA. As microgininas e a microcistina-LR podem ser consideradas como novas moléculas a serem estudadas para o desenvolvimento de fármacos inibidores da ECA. Continuar a investigação da produção desses compostos é relevante tanto por seu potencial ecotoxicológico quanto por seu potencial farmacológico.Some cyanobacterial species can produce different types of bioactive peptides (cyanopeptides), such as aeruginosins, cyanopeptolins, microginins, microviridins, anabaenopeptins and microcystins. Microcystins are well known in the scientific literature as hepatotoxins that inhibit phosphatases type 1 and 2A. Microginins are reported as inhibitors of the angiotensin converting enzyme (ACE) and other proteases, being important candidates for the development of anti-hypertensive compounds. Nevertheless, the physiological functions of these compounds have not been fully elucidated. The aim of this study is to isolate and identify cyanopeptides, namely microginins, produced by Brazilian cyanobacterial strains. The fractionation of cyanobacterial extracts was screened by ACE inhibition assays. Extracts of 59 cyanobacterial strains were produced from cultures cultivated under laboratory conditions and, in cases where microginins were found, prefractionation were carried out by solid phase extraction on a reverse phase column. The fractions obtained were tested for inhibition of ACE and analyzed by liquid chromatographymass spectrometry (LC-MS) by using precursor ion scan to monitor the loss of m/z 128 and 142, typical fragments detected from the amino acid Ahda, which is exclusively found in microginins. In cases where fractions demonstrated inhibitory activity, the fractionation was continued by semi-preparative high performance liquid chromatography for the isolation of cyanopeptides. The analyzed species belong to the genere: Microcystis, Oscillatoria, Radiocystis, Sphaerocavum, Sphaerospermopsis, Cylindrospermopsis, Leptolyngbya, Pleurocapsa, Chrooccocidiopsis, Nostoc, Brasilonema, Desmonostoc, Oculatella and Limnothrix. And other species of Pseudanabaenaceae, Nostocaceae and Michochaetaceae families did not have their peptides completely characterized. Analyses of HPLC-DAD did not revealed characteristic features by UV spectra of microginins in the 59 strains. These results were corroborated by analyses of LC-MS triple quadrupole, microginins were not detected as well. Some strains were positive for microcystin variants, showing maximum UV absorption at 238 nm and typical MS/MS spectra. Initial enzyme assays for the inhibition of ACE were performed with fractions of the control strains LTPNA 08 and 09, known as microginins\' producers. Samples fromIsrael, kindly donated by Prof. Shmuel Carmeli, of Tel Aviv University, were analyzed by mass spectrometry in the precursor ion mode for the investigation of microginins. Ions m/z 128 and 142 were founded on one sample of Israel. A HPLC method was optimized for the detection and isolation of cyanopeptides produced by culture LTPNA 08. Fractions isolated by semi-preparative HPLC were analyzed by LC-MS and collected when UV and MS spectra were characteristically similar to microginins . 4.8 mg of microginins were obtained by semi-preparative HPLC from 3 g of dried strains. The inhibition assays of ECA were performed with fractions of microginins and microcystin-LR analytical standard. The results showed that microginins as well as microcystin-LR have the potential of inhibiting ACE. Microginins and microcystin-LR can be considered as target molecules for the study of ACE inhibitors. Further research on the production of these classes of peptides is relevant because of its ecotoxicological and pharmacological potential