Genotypic and phenotypic comparison of vancomycin resistant Enterococcus faecalis isolated in 2009 and 2011 in a hospital in Minas Gerais

Enterococcus são cocos gram-positivos que ocorrem isolados, aos pares (diplococos) ou em cadeias e pertencem à microbiota intestinal de uma grande variedade de hospedeiros, de mamíferos a insetos. Enterococcus foram originalmente considerados organismos de pouca importância clínica, mas têm se revelado importantes patógenos nosocomiais. O fato dos Enterococcus possuírem formas de resistência intrínseca e adquirida a vários antibióticos dificulta o tratamento de infecções causadas por eles. Enterococcus faecalis é geralmente a espécie predominante entre os enterococos isolados, sendo de 80% a 90% das amostras clínicas. O surgimento de Enterococcus resistentes à vancomicina (VRE- do inglês vancomycin resistant enterococci) reduziu significativamente as opções de tratamento. O objetivo deste estudo foi identificar e comparar amostras de E. faecalis resistentes à vancomicina (VREfs) isolados em pacientes nos anos de 2009 e 2011, durante um programa de vigilância no Hospital Risoleta Tolentino Neves, em Belo Horizonte, MG. A identificação das espécies foi feita por multiplex-PCR com primers espécie-específicos e os E. faecalis foram selecionados para estudo. Foram realizadas a pesquisa da presença dos genes elrA, cylLL, esp e gelE, a determinação do genótipo responsável pela resistência e a caracterização do transposon que contém o gene de resistência, todos por meio de PCR. Foi também realizada a determinação da concentração inibitória mínima (CIM) de acordo com o CLSI (2013) para vancomicina, linezolida, tigeciclina e daptomicina e testes para resistência a altas concentrações de aminoglicosídeos. Por fim, a tipagem das amostras foi feita através de eletroforese em campo pulsado (PFGE- do inglês Pulsed Field Gel Eletroforesis) e MLST (Multilocus sequence typing). Foi encontrado que 22,2% dos VRE isolados em 2009 e 61,7% dos isolados em 2011 pertencem à espécie E. faecalis e estes foram utilizados no estudo. Houve surgimento de resistência à tigeciclina nos isolados de 2011, sendo 10 isolados resistentes, logo após o início do uso deste antimicrobiano no hospital. Foi encontrado um isolado de 2011 com resistência intermediária à linezolida. Todos os isolados foram sensíveis à daptomicina e altamente resistentes à vancomicina, com CIM maior que 256 μg/mL. Essa alta resistência à vancomicina é condizente com o genótipo Vana, encontrado em todas as amostras. O perfil de virulência prevalente nos VREfs em 2009 era elrA+gelE+, sendo dos pulsotipos A1 e A4 e ST103. Apenas um isolado de 2009, com pulsotipo A1 apresentou o perfil de virulência cyl+elrA+gelE+. Em 2011, o perfil de virulência prevalente foi cyl+esp+elrA+gelE+, sendo que os 12 isolados com esse perfil pertenciam aos pulsotipos B e C e ST6, que ocorreram somente em isolados de 2011. Onze amostras de 2011 apresentaram o perfil elrA+gelE+ e foram classificadas no pulsotipo A e seis amostras tem perfil cyl+elrA+gelE+ e são dos pulsotipos B e D. Resultados de PFGE mostram a inserção no hospital da linhagem ST6, um clone multirresistente amplamente disseminado em hospitais da Itália, Portugal, Espanha e Estados Unidos. Concluiu-se que houve mudanças no perfil de E. faecalis resistentes à vancomicina no hospital, ao longo dos dois anos, com aumento de resistência e linhagens mais virulentas, sendo estes motivos de preocupação.Enterococci are Gram-positive cocci occurring isolated, in pairs (diplococci) or chains and belong to the intestinal tract of a wide variety of hosts, from mammalian to insect. Enterococcus organisms were originally considered of little clinical importance, but have proved important nosocomial pathogens. The fact that Enterococcus possess intrinsic and acquired resistance to multiple antibiotics complicates the treatment of infections caused by them. Enterococcus faecalis is usually the predominant species among enterococci isolates, with 80% to 90% of the clinical samples. The emergence of vancomycin-resistant Enterococcus (VRE) significantly reduced the treatment options. The aim of this study was to identify and compare samples of vancomycin- resistant E. faecalis (VREfs) in patients in the years 2009 and 2011, during a surveillance program in Hospital Risoleta Tolentino Neves, Belo Horizonte, MG. Species identification was done by multiplex-PCR with primers species-specific and E. faecalis were selected for this study. Tests were conducted for the presence of genes elrA, cylLL, esp and gelE, the determination of the genotype responsible for the resistance and characterization of transposon containing the resistance gene, all by PCR. The minimum inhibitory concentration (MIC) was determined according to the CLSI (2013) to vancomycin, linezolid, daptomycin and tigecycline and tests for resistance to high concentrations of aminoglycosides. Finally, the samples typing was performed by pulsed field gel electrophoresis (PFGE) and multilocus sequence typing (MLST). It was found that 22.2 % of VRE isolates in 2009 and 61.7 % of isolates in 2011 belong to the species E. faecalis and these were used in the study. There was emergence of tigecycline resistance in 2011, with 10 resistant isolates, after the introduction of this drug in the hospital. One isolate from 2011 showed intermediate resistance to linezolid. All isolates were sensitive to daptomycin and highly vancomycin resistant, with MICs greater than 256 mg / mL. This high resistance to vancomycin is consistent with the vanA genotype found in all samples. The virulence profile prevalent in VREfs in 2009 was elrA+gelE+, belonging to the pulsotypes A1 and A4 and ST103. Only one isolate from 2009, presented pulsotype A1 and the virulence profile cyl+elrA+gelE+. In 2011, the prevalent virulence profile was cyl+esp+elrA+gelE+, and the 12 isolates with this profile belonged to pulsotypes B and C and ST6, which occurred only in 2011 isolates. Eleven isolates from 2011 have the profile elrA+gelE+ and were classified as pulsotype A, six isolates have profile cyl+elrA+gelE+ and are of pulsotypes B and D. PFGE results show the insertion of ST6 lineage in the hospital, a multiresistant clone widely disseminated in hospitals in Italy, Portugal, Spain and the United States. It was concluded that there were changes in the profile of E. faecalis resistant to vancomycin in the hospital over the two years, with increased resistance and more virulent strains, which are of concern