Expression, purification and characterization of the enzymes GumD and GumC involved in the biosynthesis of the exopolysaccharide produced by the bacteria Xyllela fastidiosa

A Clorose Variegada de Citrus (CVC) é uma doença que vem atingindo grandes plantações de laranjas no Brasil e outros países como Estados Unidos, França e Espanha. O principal efeito da doença é o surgimento de manchas amarelas nas folhas que progridem para toda a extensão levando-a à necrose. Os frutos são pequenos, apresentam casca dura, sendo impróprios para o consumo. O agente causador da CVC é a bactéria Xylella fastidiosa que é limitada ao xilema. A bactéria é transmitida por insetos conhecidos como \"cigarrinhas\" que se alimentam na seiva do xilema. Esta bactéria apresenta em seu genoma um Operon contendo 9 genes (B,C,D,E,F,H,J,K,M) responsáveis pela biossíntese do exopolissacarídeo denominado goma fastidiana, que pode estar envolvido na sua patogenicidade. No presente trabalho, realizou-se estudos com as enzimas GumD (uma enzima glicosiltransferase I que faz a primeira adição de glicose-l-fosfato ao lipídeo prenol) e GumC (que provavelmente está envolvida na etapa de polimerização e/ou secreção do polissacarídeo formado através da membrana da bactéria), com o objetivo de contribuir para melhor entendimento da via biossintética. O gene gumD, que codifica a enzima GumD, foi clonado nos vetores de expressão pMAL¬c2x e pKK223-3. A proteína GumD foi purificada através das cromatografias de troca aniônica e filtração a gel. O peso molecular e o pI da enzima foram determinados usando respectivamente a técnica de filtração a gel e o sistema Fast de eletroforese. A enzima foi caracterizada quanto ao seu enovelamento através da técnica de Dicroísmo Circular, apresentando um espectro característico de estrutura secundária enovelada, composta predominantemente por a-hélices. O gene gumC, que codifica para a proteína GumC, foi clonado nos vetores de expressão pMAL-c2x (no qual a enzima é expressa em fusão com a proteína MBP - Maltose Binding Protein) e pET29a (a proteína é expressa sem fusão). A proteína em fusão GumC-MBP foi parcialmente pura através da coluna de amilose e foi caracterizada através da técnica de Imunoblotting. A enzima GumC expressa no vetor pET29a está em fase de purificação. Anticorpos anti-GumC-MBP foram produzidos em camundongos e serão utilizados como uma forma de caracterizar a proteína GumC expressa sem fusão. Estudos estruturais destas enzimas poderão trazer informações fundamentais para o conhecimento da via biossintética, assim como para o desenvolvimento de inibidores específicosThe Citrus Variegated Chlorosis (CVC) is a serious disease of orange trees in countries like Brazil, USA, France and Spain. Typical disease symptoms include conspicuous variegations with chlorotic areas on the upper side and small necrotic lesions on the lower side of the leaves. The affected fruits are smaller, hardened and without commercial value. Citrus variegated chlorosis is caused by Xylella fastidiosa, which is a xylem-limited bacterium. X fastidiosa is transmitted by specific sharpshooter leafhoppers when the insect feeds on the xylem sap. X fastidiosa has a nine-gene operon (B, C, D, E, F, H, J, K, and M genes) responsible for the biosynthesis of exopolysaccharides, denoted fastidian gum, which can be involved in its pathogenicity. GumD glycosyltransferase enzyme adds the first sugar, glycose-l-phosphate, to the prenol lipid. GumC enzyme probably is involved in the polymerization and/or exportation of the fastidian gum through the membrane of the bacterium. Studies were done on the GumD and GumC enzymes with the aim of getting a better understanding of the exopolysaccharide biosynthetic pathway. The gumD gene was cloned into the pMAL-c2x and pKK223-3 expression vectors, and GumD protein was purified through ion exchange and size exclusion chromatography. Then GumD molecular mass and pl were determined using, respectively, size exclusion chromatography and electrophoresis. In addition, according to circular dichroism spectroscopy, GumD prevalent secondary structure is u-helix. On the other hand, the gumC gene was cloned in two expression vectors: pMAL-c2x (the protein is expressed in fusion with Maltose Binding Protein ¬MBP) and pET29a (the protein is expressed without fusion in our strategy). GumC¬MBP, the protein in fusion, was partially purified using an amylose column and the fusion between GumC and MBP was confirmed with imunoblotting technique. Purification trials of GumC enzyme expressed in pET29a are in course. Anti-GumC¬MBP antibodies were already produced in mice and they will be used to characterize the GumC protein expression without fusion. Structural studies of GumD and GumC enzymes will provide information about the fastidian gum biosynthetic pathway, as well as to the development of specific inhibitor