Study of the interaction of Sporothrix schenkii with murine macrophages

Sporothrix shenckii, um fungo dimórfico, termo-dependente, é encontrado na natureza associado com matéria orgânica em decomposição, como, espinhos, folhas secas, madeira e também na água. Este fungo é o agente causador da esporotricose, que ocorre com maior freqüência em pessoas que trabalham com o solo e vegetais contaminados com os esporos do fungo, sendo considerada uma doença ocupacional. A contaminação acontece com a inoculação traumática do material contaminado e em alguns casos por inalação dos esporos. Quando infecta o organismo humano, bem como outros mamíferos ou quando cultivado a 37°C, passa para a forma de levedura. É comum em áreas de clima tropical e subtropical, com alta umidade. Apresenta distribuição mundial, sendo que, atualmente no Brasil, são relatados casos em São Paulo, Rio de Janeiro e no Rio Grande do Sul. No Rio de Janeiro, a esporotricose tem sido relatada como doença endêmica, onde o agente etiológico é transmitido de gatos para homens. A esporotricose apresenta caráter crônico, polimórfico e com formação granulamatosa. As formas clínicas e a patogênese dependem do sítio de inoculação do fungo e da resposta imunológica do hospedeiro. O mecanismo de defesa e suscetibilidade do organismo, bem como a disseminação da infecção por este fungo ainda não são totalmente conhecidos. O estado de saúde do paciente contribui diretamente para o estabelecimento da doença, sendo que, alcoolismo, diabete, imunidade comprometida e uso extensivo de drogas imunosupressoras são fatores que podem predispor à infecções severas. Neste trabalho estudamos in vitro a interação do S. schenckii com macrófagos murinos. Por meio de técnicas de fagocitose, ELISA, dosagem de óxido nítrico, viabilidade de leveduras, citometria de fluxo e RT-PCR foram realizados ensaios da atividade de macrófagos. Desta forma foram gerados alguns dados para o melhor entendimento da resposta de defesa nesta doença. Nos estudos realizados, concluímos que os anticorpos gerados nos camundongos pela infecção por S. schenckii foram capazes de induzir a fagocitose do fungo. Também, após a fagocitose das leveduras pelos macrófagos, incubados com laminarina ou manana, houve inibição significativa da produção de TNF-α, indicando que os receptores dectina-l e manose, respectivamente, estão relacionados à produção desta citocina. O soro, contendo os anticorpos do animal infectado, também induziu forte produção desta citocina, mostrando que a entrada do fungo via receptor Fc pode também induzir a produção dessa citocina. Verificamos ainda que a fagocitose de leveduras, pelos macrófagos, na presença de soro de camundongo infectado, induziu alta produção de IL-10. Quando analisamos a expressão de genes presentes nos macrófagos, observamos forte expressão de TLR-2 e MyD-88, na presença das leveduras. Já a expressão de iNOS pelos macrófagos, observamos que foi maior na presença do fungo somente quando as leveduras foram incubadas com o soro, após o período de 72 horas. Em seguida, ao dosar a produção de Óxido Nítrico (NO), verificamos no período de 3 dias de incubação, que houve redução significativa na concentração de NO produzida pelos macrófagos, quando estes foram incubados com o fungo. Porém, quando as leveduras foram opsonizadas pelo soro, houve aumento da produção de NO após 72 horas de incubação. Outra verificação importante foi que os macrófagos foram capazes de destruir as leveduras fagocitadas na presença de soro.Sporothrix schenckii is a dimorfic fungus, term-dependent, find in nature associated with organic material at decomposition, like thorns, wheat leaves, wood and water. This is the fungi agent that causes sporothricosis, which happens with more frequency with people that work with land and green, contaminated with mold of fungus. That is why it is considered a occupational disease. The contamination happens with traumatic inoculation of material and some cases with inhalation of mold. When a human is infected, as well as other mammals or when cultivate at 37°C, it tums into the yeast form. Is common at tropical and moisture weather areas. Is found all around the world, and nowadays at Brazil, with cases related São Paulo, Rio de Janeiro and Rio Grande do Sul. At Rio de Janeiro, sporothricosis are related like endemic disease, where the etiologic agent is transmitted by cats to men. Sporothricosis is a chronic, polimorfic disease, and with form granulamatosa. The clinical type and the pathogenesis depend on the way of inoculation and the response of immunological system of the host. The defense and suscebility of the organism, as dissemination of infection with this fungi is not yet totally known. The patient\'s health state contributes directly to the disease, as much as alcoholism, diabetes and immunity deficiency and the extensive use of immunosuppressive drugs are factors that can bring to harder infection. Here, we studied in vitro the interaction of S. schenckii with murine macrophages. Using phagocytosis assay, ELISA, dosage of oxide nitric, CFU assay, flow citometry and RT-PCR were analysed activity of macrophages. We produced some results in order to better understand the response of defense with this disease. In the present study, we conclude that antibodies generated in mice by infection with S. schenckii were capable to promote phagocytosis of fungus. Also, when macrophages and yeast were incubated with laminarin or mannan, we had significant decrease in production of TNF-α, showing that receptors dectin-l and manose, respectively, are related with production this cytokine. The antibodies of mice infected with S. schenckii, also produced hard level this cytokine showing that entrance of fungus by receptor Fc can produce TNF- α. Besides, we verify that phagocitosys of yeast, with sera of infected mice, induct hard production of IL-10. When we analysed the expression of genes of macrophages, we observed hard expression of TLR-2 and MyD-88, when yeast were present. However, the expression of iNOS by macrophages, was more hard with yeast only when sera was present, before 72 hours. Similarly, when yeast were opsonized by sera, we had increase of production of NO after 72 hours of incubation. After, macrophage were capable to destruct yeast phagocyted when sera was present