Study of salivary proteome and immunoproteome of cattle tick, Rhipicephalus (Boophilus) microplus, for identification and characterization of silent antigens

Infestações com Rhipicephalus microplus, o carrapato dos bovinos, causam enormes prejuízos econômicos para a pecuária. Os carrapatos estão desenvolvendo resistência aos carrapaticidas que, além dessa desvantagem, deixam resíduos em carne e leite. Vacinas anticarrapato representam uma alternativa sustentável de controle de infestações, mas as atualmente disponíveis têm efeitos parciais e transitórios. Surge, assim, a necessidade de identificar novos antígenos vacinais. Para alcançar esse objetivo este trabalho explora o fato de que bovinos apresentam fenótipos contrastantes e herdáveis de infestações que são específicos de certas raças. Além disso, o nível de imunidade do hospedeiro afeta a transcrição de genes de glândulas salivares do carrapato, órgão que produz proteínas que medeiam o parasitismo. A hipótese de trabalho é a que os diferentes níveis da imunidade anticarrapato do hospedeiro afetam, também, a composição salivar do parasita. Assim, em carrapatos alimentando-se em hospedeiros resistentes as proteínas que são cruciais ao parasitismo poderão estar ausentes ou deficientes na sua saliva e por isso os carrapatos não terminam sua refeição de sangue. A neutralização dessas mesmas proteínas pela imunidade humoral pode ter o mesmo efeito e por isso, essas proteínas constituem bons antígenos vacinais. Assim, o objetivo do trabalho foi identificar novos antígenos vacinais em saliva de fêmeas e glândulas salivares de ninfas, machos e fêmeas de carrapatos alimentados em hospedeiros resistentes e suscetíveis, bem como em larvas não alimentadas oriundas de ovos de fêmeas alimentadas nestes mesmos hospedeiros. Para isso, foram empregadas abordagens de sequenciamento de nova geração \"RNA-Seq\" (454) e abordagens proteômicas, como análise diferencial em gel (DIGE) e Western Blots (imunoproteoma) seguido de sequenciamento de massa, além da tecnologia de identificação de proteínas multidimensionais (ou Multidimensional Protein Identification Technology, MudPIT) para descrever o proteoma das glândulas salivares e da saliva de fêmeas. A análise transcriptômica resultou no sequencimanto de 1.999.086 reads que permitiu identificar e classificar 11.676 sequências codificadoras (CDS), muitas das quais (3.600 CDS) contêm peptídeo sinal que é indicativo de secreção, portanto podendo estar presente na saliva e Resumo Gustavo Rocha Garcia apresentar função importante na hematofagia. Por meio de MudPIT, identificamos 321 proteínas salivares diferentes, além de 126 proteínas no DIGE e 266 proteínas nos imunoproteomas. Muitas dessas proteínas podem ser consideradas antígenos potenciais por estarem associadas com a hematofagia/parasitismo, tais como proteases, nucleases, inibidores de proteases, peptídeos antimicrobianos, proteínas de fixação, entre outros, inclusive proteínas ainda não caracterizadas. A maioria dos genes codificantes dessas proteínas está mais expressa em carrapatos alimentados em hospedeiros suscetíveis, principalmente em carrapatos machos. Além disso, muitas dessas proteínas não são reconhecidas por soros bovinos, inclusive soros de bovinos infestados, embora soros de bovinos infestados e resistentes ao carrapato apresente a maioria das reatividades. O conjunto dos resultados sugere que em nível de proteína a composição da saliva também é afetada pelos diferentes níveis de imunidade dos hospedeiros, além de variar com o ciclo de vida do carrapato. Desse modo, concluímos que as estratégias de investigação empregadas foram satisfatórias para identificar um conjunto de antígenos salivares do carrapato R. microplus que representam proteínas alvos para compor vacinas multicomponentes anticarrapato.Infestation with Rhipicephalus microplus, the cattle tick, causes huge economic losses to livestock. Ticks are developing resistance to acaricides that, besides this disadvantage, leave residues in meat and milk. The anti tick vaccines represent a sustainable alternative of the infestations control, but the currently available has partial and transient effects. Thus arises the need to identify new vaccine antigens. To achieve this goal, this work explores the fact that cattle exhibit contrasting phenotypes and inheritable of infestations that are specific to certain breeds. Furthermore, the level of immunity of the host affects gene transcription tick salivary gland, organ that produces proteins that mediate the parasitism. The working hypothesis is that different levels of anti tick immunity of host affect also the salivary composition of the parasite. So in ticks feeding on resistant hosts the proteins that are crucial to parasitism may be absent or deficient in their saliva, and by this the ticks do not finish your meal blood. The neutralization of these same proteins by humoral immunity can have the same effect and by this, these proteins are good vaccine antigens. So, the aim of the study was to identify new vaccine antigens in saliva from females and salivary glands of nymphs, males and females of ticks fed on resistant and susceptible hosts as well as in unfed larvae originating from eggs of females fed on these same hosts. To this, were employed sequencing approaches of new generation \"RNA-Seq\" (454) and proteomic approaches, such as differential analysis in gel (DIGE) and Western Blots (immunoproteomics) followed by sequencing mass, besides the Multidimensional Protein Identification Technology (MudPIT) to describe the proteome of the salivary glands and saliva of females. The transcriptomics analysis identified 11,676 coding sequences (CDS), many of which (3,600 CDS) contain predicted signal peptide indicative of secretion, therefore may be present in saliva and provide an important function in blood feeding. Through MudPIT, we identify 321 different salivary proteins, besides 126 proteins in DIGE and 266 proteins in immunoproteomics. Many of these proteins may be considered as potential antigens to be associated with the blood meal/ parasitism, such as proteases, nucleases, protease inhibitors, antimicrobial peptides, proteins of attachment, among Abstract Gustavo Rocha Garcia others, including proteins not yet characterized. Most of the genes encoding of these proteins are more expressed in ticks fed on susceptible hosts, especially in male ticks. Moreover, many of these proteins are not recognized by bovine sera, including sera from infested hosts, although sera from infested and resistant host to tick present the most reactivities. The overall results suggest that in protein level, the composition of saliva is also affected by the different levels of immunity of the host, besides vary with the tick life cycle. Thus, we conclude that the research strategies employed were satisfactory to identify a set of tick salivary antigens from R. microplus that represent target proteins for composing anti tick multicomponent vaccines