Pathogenesis of systemic hemostatic disturbances in Bothrops jararaca snake envenomation

Acidentes pela serpente Bothrops jararaca (Bj) causam distúrbios hemostáticos em pacientes. Sabe-se que a fisiopatologia desses distúrbios é complexa, porém não se conhece a relevância das duas principais famílias de enzimas presentes no veneno de Bj com atividade anti-hemostática, as metaloproteinases e serinaproteases, para promover esses distúrbios. Além disso, a injúria local induzida no local da inoculação do veneno poderia estimular a liberação de fator tissular (TF) na circulação sanguínea, favorecendo a coagulopatia. Assim, o objetivo deste projeto foi investigar a contribuição das metaloproteinases e serinaproteases do veneno de Bj e a expressão de TF para a gênese dos distúrbios hemostáticos, utilizando um modelo experimental em ratos. O veneno de Bj foi previamente incubado com Na2-EDTA 13 mM ou AEBSF 4 mM para inibir as metaloproteinases e serinaproteases, respectivamente, e administrado pelas vias s.c. ou i.v. Após 3 e 6 h, os parâmetros hemostáticos e de expressão proteica de TF e isomerase de dissulfeto proteico (PDI) foram avaliados. Os níveis de veneno circulante se elevaram mais rapidamente no grupo injetado pela via i.v., e o tratamento do veneno com Na2-EDTA ou AEBSF não reduziu os níveis circulantes de veneno em comparação ao grupo controle com veneno. Em comparação com animais tratados com salina, houve uma queda abrupta na contagem plaquetária em todos os grupos e tempos administrados com veneno de Bj, sendo o grupo administrado pela via i.v. o que apresentou uma queda de maior intensidade. O pré- tratamento do veneno com o AEBSF não impediu o consumo plaquetário e somente o Na2-EDTA parcialmente reverteu a plaquetopenia. Por outro lado, o veneno não tratado causou consumo de fibrinogênio plasmático, geração de produtos de degradação de fibrinogênio e fibrina, prolongamento do tempo de protrombina (TP) e hemorragia no local de inoculação do veneno. No entanto, o Na2-EDTA, e não o AEBSF, bloqueou completamente esses parâmetros. Não houve redução dos níveis de fator VII ao longo do envenenamento, e seus níveis apresentou um notável aumento nos animais envenenados no grupo 6 h s.c. Ratos envenenados apresentaram notável aumento dos níveis do TF plasmáticos, que foi inibido pelo pré-tratamento com o Na2-EDTA. Houve também aumento da expressão de TF no pulmão e pele. Nos grupos injetados com veneno de Bj em 6 h ocorreu uma redução da expressão de PDI. Os resultados mostram que as metaloproteinases são componentes essenciais para o desencadeamento da coagulopatia do envenenamento. No entanto, as metaloproteinases e serinaproteases não estão diretamente envolvidas na gênese da plaquetopenia induzida pelo veneno de Bj e outros mecanismos/toxinas parecem estar envolvidos. Os resultados também demonstraram o aumento dos níveis de TF plasmático durante o envenenamento, similar àquele observado na coagulação intravascular disseminada, o que sugere a importância da geração de TF como um mecanismo para promover distúrbios sistêmicos da coagulaçãoBites by Bothrops jararaca (Bj) snakes evoke hemostatic disturbances in patients. The pathophysiology of such disturbances is complex, but the importance of the major enzyme families with anti-hemostatic activity, found in Bj venom. i.e., metalloproteinases and serine proteinases, to promote them is not known. Moreover, the local injury induced at the site of venom inoculation might also stimulate tissue factor (TF) release into bloodstream, favoring the coagulopathy. The aim of this study was to investigate the contribution of metalloproteinases and serine proteinases of Bj venom, as well the TF expression to the genesis of hemostatic disturbances, using an experimental model in rats. Crude Bj venom was previously incubated with 13 mM Na2-EDTA or 4 mM AEBSF to inhibit metalloproteinases and serine proteinases, respectively, and administered s.c. or i.v. into rats. After 3 and 6 h, hemostatic parameters and TF and protein disulfide isomerase (PDI) expression were evaluated in plasma and samples of skin and lungs. Circulating venom levels increased more rapidly in i.v. group, and neither Na2-EDTA nor AEBSF treatment reduced the circulating venom levels in comparison with the control group. Platelet counts showed a marked decrease in all groups administered with Bj venom in comparison with saline-treated rats; the fall in platelet counts was more intense in animals administered i.v. with Bj venom. The pre-treatment of venom with AEBSF failed to block the fall in platelets count, and only Na2-EDTA minimally reversed thrombocytopenia. Nonetheless, non-treated venom provoked plasma fibrinogen consumption, generation of fibrin(ogen) degration products, prolongation of prothrombin time (TP), and hemorrhage at the site of venom inoculation. However, Na2-EDTA, but not AEBSF, completely blocked these parameters. Factor VII levels were not reduced during envenomation, and they showed a marked increase in envenomed rats at 6 h in the s.c. group. Envenomed rats showed a marked increase in plasma TF levels, which was also blocked by Na2-EDTA. In addition, TF expression was increased in the lung and skin samples. PDI expression in skin was reduced at 6 h in all groups treated with venom. These findings demonstrate that metalloproteinases are essential venom components involved in the Bj-induced coagulopathy. Nonetheless, metalloproteinases and serine proteases had no direct involvement in the genesis of Bj-induced thrombocytopenia and other venom mechanisms/toxins seem to be associated therein. High levels of TF in plasma may occur during snake envenomation, so that the etiopathogenesis of coagulopathy in snake envenomation resembled that of true disseminated intravascular coagulation syndrom