Fluorescence anisotropy: applications in model membranes.

O estudo de agregados anfifílicos é de extrema importância devido à sua mimetização de membranas celulares, que são essenciais para a vida da célula. Sabe-se que os fosfolipídios não possuem estruturas moleculares bem definidas nas membranas, porém exercem um papel essencial na manutenção da sua integridade. Fosfolipídios zwitteriônicos são um dos principais componentes estruturais das membranas celulares, e um modelo simplificado destas membranas são as bicamadas que estes fosfolipídios podem formar em meio aquoso. A principal característica destas bicamadas lipídicas é a auto-organização dos lipídios, fazendo-se necessário o estudo de processos naturais e espontâneos, como suas propriedades estruturais e dinâmicas. A espectroscopia de fluorescência tem sido utilizada no estudo de diversos processos e sistemas de interesse biológico, principalmente por medidas de anisotropia de fluorescência, que fornece informações sobre a dinâmica rotacional das sondas fluorescentes inseridas nos sistemas de interesse, refletindo efeitos combinados de flexibilidade, fluidez e interações estáticas com moléculas circundantes. Neste trabalho examinamos as propriedades estruturais e dinâmicas de membranas modelo fosfolipídicas formadas de 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) por técnicas relacionadas à espectroscopia de fluorescência, principalmente por medidas de anisotropia do estado estacionário e resolvida no tempo, das sondas fluorescentes 1,6-diphenil-1,3,5-hexatrieno (DPH), 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-il (NBD) ligado em diferentes regiões das moléculas fosfolipídicas e também da sonda lipofílica 2-amino-N-hexadecil-benzamida (Ahba). As medidas foram realizadas tanto acima como abaixo da temperatura de transição de fase das bicamadas fosfolipídicas de DPPC, na fase gel e líquido-cristalina, devido à diferença da organização lateral das cadeias de hidrocarboneto nestas duas fases. Medidas de espalhamento dinâmico de luz foram realizadas para confirmar a formação das vesículas unilamelares pelo processo de extrusão da suspensão lipídica contendo vesículas multilamelares, e a técnica de calorimetria diferencial de varredura foi empregada para verificar se baixa concentração das sondas fluorescentes nas vesículas afetam seu empacotamento lipídico. Pelos resultados obtidos, constatamos que os comportamentos das três sondas fluorescentes diferem em ambas as fases das bicamadas fosfolipídicas, revelando suas propriedades estruturais e dinâmicas, principalmente pelas diferentes localizações dos fluoróforos. Verificamos que, devido à afinidade pela região hidrofóbica, o movimento do DPH é restrito ao movimento \"wobbling\", limitado pelas cadeias alifáticas. Para o NBD em lipídios marcados, o movimento do análogo fluorescente como um todo depende da localização do fluoróforo e de sua conformação em ambas as fases das bicamadas lipídicas. Devido à localização do grupo fluorescente da sonda Ahba na interface das bicamadas lipídicas, verificamos que seu movimento rotacional aumenta à medida que a bicamada torna-se mais fluida, mostrando uma dependência deste movimento com a microviscosidade destas bicamadas.The study of amphiphilic aggregates is extremely important due to their cell membrane mimic, which are essential for the life of the cell. It is known that phospholipids do not have molecular structure well defined in membranes, but play an essential role in maintaining of their integrity. Zwitterionic phospholipids are one of the main components of cell membranes, and a simplified model for the membranes are the bilayers they can form in aqueous medium. The main characteristic of lipid bilayers is the self-organization of lipids, making it necessary to study natural and spontaneous process, as their structural and dynamical properties. The fluorescence spectroscopy has been used to study many processes and systems of biological interest, especially by measurement of fluorescence anisotropy, which gives information about the rotational dynamics of the fluorescent probe inserted in the systems of interest, reflecting the combined effects of flexibility, fluidity and static interactions with surrounding molecules. In this work we examined the structural and dynamic properties of phospholipid model membranes formed of 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocoline DPPC by techniques related to fluorescence spectroscopy, mainly by measurements of steady-state and time resolved anisotropy of the probes 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene (DPH), 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-yl (NBD) attached to different regions of phospholipid molecules and also the lipophilic probe 2-amino-N-hexadecyl-benzamide (Ahba). The measurements were perfomed above and below of the phase transition temperature of the phospholipid bilayers of DPPC, gel and liquid-crystalline phase, due to the difference in the lateral organization of hydrocarbon chains in these two phases. Measures of dynamic light scattering (DLS) was performed to confirm the formation of the unilamellar vesicles by extrusion of lipid suspension containing multilamellar vesicles, and the technique of differential scanning calorimetry (DSC) was used to verify if the low concentration of fluorescent probes in lipid vesicles affect its packing. From the results, we found that the behavior of the three different fluorescent probes differ in both phases of phospholipid bilayers, revealing their structural and dynamic properties, mainly because to specific locations of the fluorophores. We verify that, due to the affinity for the hydrophobic region, the motion of the DPH is restricted to the \"wobbling\" motion, limited by hydrocarbon chains. For the NBD labeled in lipids, the motion of the fluorescent analogues as a whole depends on the location of the fluorophore and on the lipid conformation in both phases of lipid bilayers. Because of the location of the fluorescent group of the probe Ahba in the interface of lipid bilayers, we found that its rotational motion increases as the bilayers becomes more fluid, showing a dependency of the motion with the microviscosity of these bilayers