Antimicrobial and cytotocixity evaluation of lysozymes

O aumento na procura por produtos naturais pelo mercado farmacêutico, cosmético e alimentício demanda pesquisas no desenvolvimento desses produtos. Esses são direcionados à obtenção de substâncias de origem vegetal ou animal, assim como, para produtos biotecnológicos. Investigações quanto à atividade antibacteriana de proteínas e peptídeos são realizadas. Dentre essas substancias, podemos citar as lisozimas, proteínas que hidrolisam as ligações β 1-4 glicosídicas entre o ácido N-acetilmurâmico e N-acetilglicosamina, presentes no peptidoglicano da parede celular bacteriana. Além disso, apresentam atividade de quitinase, ou seja, quebram a ligação glicosídica da quitina presente na parede fúngica. As lisozimas apresentam alta especificidade pela parede microbiana indicando aparente ausência de efeitos tóxicos aos humanos. Assim, tornando-a candidata a agente antimicrobiano em formulações cosméticas e farmacêuticas. A lisozima de ovo de galinha tem atividade antimicrobiana, entretanto não havia estudos relacionados com os micro-organismos contaminantes normalmente encontrados em produtos farmacêuticos e cosméticos. Além disso, a lisozima recombinante de Musca domestica (MdL1) não possui ainda sua atividade antimicrobiana definida. Os objetivos do trabalho foram:1) Obtenção da lisozima recombinante de Musca domestica (MdL1); 2) Avaliação a atividade antimicrobiana da MdL1 e de lisozima de ovo de galinha, Hen Egg White Lysozyme (HEWL), frente à Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Micrococcus luteus (ATCC 4698), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Escherichia coli (ATCC 8739), Candida albicans (ATCC 10231) e Aspergillus niger (ATCC 16404); 3) Avaliação da toxicidade da lisozima em cultura de células de fibroblastos (ATCC CCL-92). A MdL1 foi obtida por meio de expressão gênica em Pichia pastoris GS115 (Invitrogen), concentrada utilizando polietilenoglicol 6000 e dialisada contra água deionizada através da membrana com porosidade seletiva de 12kDa. A homogeneidade foi analisada por eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes; e a atividade catalítica foi avaliada utilizando células liofilizadas de Micrococcus luteus como substrato. A atividade antimicrobiana foi determinada por método específico para cada enzima. A toxicidade in vitro das amostras foi avaliada pela viabilidade celular de fibroblastos ATCC CCL-92. A MdL1 obtida apresentou características de homogeneidade adequadas e atividade de 108,35 U/mg. A HEWL mostrou-se ativa contra S. aureus, M. luteus e C. albicans. A MdL1 apresentou-se ativa contra M. luteus, apenas. Devido a ausência de atividade antimicrobiana a MdL1 não foi submetida a avaliação citotóxica. Em relação à HEWL não demonstrou citotoxicidade na avaliação prévia realizada.The increase in the search for natural products by pharmaceutical, cosmetic and food markets requires researches in these products development. These are directed to obtaining substances of vegetal or animal origin, as well as biotechnological products. The research in relation to antibacterial activity of proteins and peptides is carried out. Among these substances, it is possible to mention the lysozyme, protein that catalyze the break of 1,4-beta-D glucosidic bond between N-acetylmuramic acid and N-acetilglicosamine which are present in peptidoglicane of the bacterial cell wall. Besides, there is kitinase activity, that is, they break the glicosidic bond of chitin which is present in fungal wall. The lysozymes show high specificity by microbial wall indicating apparent absence of toxicological effects to human beings. Therefore, it becomes the candidate to antimicrobial ingredient in cosmetic and pharmaceutical dosage forms. The hen egg white lysozyme has antimicrobial activity, however there were no studies related to spoiled microorganism usually found in pharmaceutical and cosmetic products. In addition, there were not studies about microbial activity of recombinant Musca domestica lysozyme 1 (MdL1). The aim of this research was: 1) To obtain MdL1; 2) Evaluation of MdL1 and hen egg white lysozyme (HEWL) antimicrobial activity against Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Micrococcus luteus (ATCC 4698), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Escherichia coli (ATCC 8739), Candida albicans (ATCC 10231) e Aspergillus niger (ATCC 16404); 3) Evaluation of lysozyme toxicity in fibroblast cells culture (ATCC CCL-92). The MdL1 was expressed as recombinant protein in Pichia pastoris GS115 (Invitrogen), concentrated using polyethylene glycol 6000 and dialyzed against deionized water through the selective porosity of 12kDa membrane. The homogeneity was analyzed by electrophoresis in sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and the catalytic activity was evaluated using lyophilized cells of Micrococcus luteus as substract. The antimicrobial activity was evaluated using specific methods for each enzyme. The sample toxicity was evaluated by cell viability using ATCC CCL-92 fibroblasts. The MdL1 obtained presented suitable homogeneity characteristics and activity of 108.35 U/mg. The HEWL has showed activity against S. aureus, M. luteus e C. albicans. MdL1 only showed activity against M. luteus. Due to the absence of antimicrobial activity of MdL1 in the evaluated concentration it was not submitted to the cytotoxicity test. Regarding HEWL, it has not showed citotoxicity in the previous test