Study of plastidial FtsH proteases targeting to thylakoid membranes

O complexo FtsH em Arabidopsis, presente nos tilacóides, é formado pelas subunidades FtsH1/FtsH5 (tipo A) e FtsH2/FtsH8 (tipo B). Os tipos A e B apresentam grande identidade em seus domínios maduros, porém nenhuma similaridade é observada na região amino-terminal do peptídeo de trânsito. Em um experimento de importação em cloroplastos isolados, FtsH2 e FtsH5 foram importadas e subsequentemente integradas aos tilacóides através de um mecanismo de processamento em duas etapas que resultou em um domínio lumenal amino-proximal, uma única âncora transmembrânica e um domínio carboxi-proximal estromal. A integração da FtsH2 em tilacóides isolados foi totalmente dependente do gradiente de prótons, enquanto que a integração da FtsH5 foi dependente de NTPs, sugerindo que a inserção na membrana ocorre pelas vias TAT e Sec, respectivamente. Tal observação foi corroborada por experimentos de competição in-organello e inibição por anticorpos específicos. Os domínios amino-proximais até as âncoras transmembrânicas foram suficientes para a correta integração aos tilacóides. A região madura da FtsH2 apresentou incompatibilidade com a maquinaria Sec, como demonstrado pela troca de peptídeos de trânsito. A incompatibilidade não parece ser determinada por qualquer elemento específico da FtsH2, uma vez que nenhum domínio isolado apresentou incompatibilidade com a via Sec de transporte. Tal fato sugere uma incompatibilidade estrutural que requer a FtsH2 intacta. A descoberta que as subunidades FtsH do tipo A e B, que apresentam grande identidade e usam diferentes vias de integração para formar o mesmo complexo multimérico é uma observação nova e interessante para o estudo da biogênese de proteínas de membranas. O mecanismo de regulação que governa a atividade do complexo FtsH em Arabidopsis é ainda desconhecido, entretanto é proposta a existência de fatores adicionais. Dessa forma, a proteína plastidial FtsH de Arabidopsis foi usada como isca em um rastreamento por duplohíbrido de levedura. O rastreamento resultou em 48 colônias que ativaram os genes repórteres histidina e adenina. Entre todos os cDNAs sequenciados, foi encontrado um candidato em potencial denominado FIP (FtsH5 Interacting Protein). Experimentos GST Pull-Down também indicam uma interação entre FtsH5 e FIP. O precursor FIP radioativo foi incubado com cloroplastos de ervilha. Após a incubação, os cloroplastos foram lisados e separados em estroma e tilacóides. FIP permaneceu associada exclusivamente à fração membranosa dos tilacóides. A inserção na membrana foi verificada através da resistência ao tratamento com álcali e o tratamento dos tilacóides com protease resultou em um fragmento protegido, característico de proteínas inseridas na membrana. A construção FtsH5::GFP transformada em Nicotiana tabacum resultou no direcionamento do gene quimérico aos cloroplastos. Dessa forma, assim como FtsH5, FIP é uma proteína plastidial que está localizada na membrana dos tilacóides. Géis nativos utilizando FIP radioativa mostram que ela está associada a um complexo de aproximadamente 450 kDa, que é o tamanho esperado para o complexo tilacoidal FtsH em Arabidopsis. Como as proteínas FtsH apresentam tanto o domínio ATPase quanto protease, acreditamos que FIP pode de alguma forma modular a atividade do complexo FtsH nos tilacóides.The Arabidopsis thylakoid FtsH protease complex is composed of FtsH1/FtsH5 (type A) and FtsH2/FtsH8 (type B) subunits. Type A and type B subunits display a high degree of sequence identity throughout their mature domains, but no similarity in their amino-terminal targeting peptide regions. In chloroplast import assays, FtsH2 and FtsH5 were imported and subsequently integrated into thylakoids by a two-step processing mechanism that resulted in an amino-proximal lumenal domain, a single transmembrane anchor, and a carboxyl proximal stromal domain. FtsH2 integration into washed thylakoids was entirely dependent on the proton gradient, whereas FtsH5 integration was dependent on NTPs, suggesting their integration by Tat and Sec pathways, respectively. This finding was corroborated by in organello competition and by antibody inhibition experiments. The amino proximal domains through the transmembrane anchors were sufficient for proper integration. The mature FtsH2 protein was found to be incompatible with the Sec machinery as determined with targeting peptide-swapping experiments. Incompatibility does not appear to be determined by any specific element in the FtsH2 domain as no single domain was incompatible with Sec transport. This suggests an incompatible structure that requires the intact FtsH2. That the highly homologous type A and type B subunits of the same multimeric complex use different integration pathways is a striking example of the notion that membrane insertion pathways have evolved to accommodate structural features of their respective substrates. The regulation mechanism which governs the Arabidopsis FtsH complexs activity is still unknown, but it is proposed the presence of additional factors. For this reason, the plastidial Arabidopsis FtsH5 was used as bait in a yeast two hybrid screening. The screening resulted in 48 colonies that activated the histidine and adenine reporter genes. Among all the sequenced cDNAs we have found a potential candidate named FIP (FtsH5 Interacting Protein). GST Pull-Down experiments also indicate an interaction between FtsH5 and FIP. Radiolabeled FIP was incubated with intact isolated chloroplasts. After incubation, intact chloroplasts were lysated and separated into stroma and thylakoids. FIP remained associated exclusively with the thylakoid membrane fraction. The insertion into membrane was verified throughout resistance to alkali treatment and the thylakoid protease treated fraction resulted in a protected fragment, characteristic of membrane-inserted proteins. Agroinfiltrated Nicotiana tabacum leaves with a FtsH5::GFP construct resulted that the chimeric gene was targeted to chloroplasts. Thus, as FtsH5, FIP is a plastidial protein which is located into thylakoid membrane. Blue native gels using radiolabeled FIP protein show that it runs associated with a complex around 450 kDa, which is the expected size for the Arabidopsis FtsH thylakoidal complex. As FtsH proteins present both ATPase and protease domains, we believe that FIP can somehow modulates the activity of the thylakoidal FtsH complex