Biotechnological aspects of bacteria-sugarcane (Saccharum sp., L.) interactions

A cana-de-açúcar é uma das mais importantes culturas para o Brasil e vem recebendo significativa atenção devido à crescente substituição de combustíveis fósseis por fontes renováveis e menos poluentes de energia como o etanol. Consequentemente, os aspectos biotecnológicos oriundos da interação de bactérias e cana-de-açúcar devem ser mais bem avaliados, além disso, estudos de interação planta-microrganismo desenvolvidos em países tropicais são ainda incipientes. As bactérias interagindo com as plantas de interesse agronômico podem acarretar os mais diversos benefícios, com ênfase na promoção do crescimento vegetal e da fitossanidade. Dentre essas bactérias, diversas linhagens de Pantoea agglomerans têm sido isoladas intimamente associadas a várias espécies vegetais. As bactérias pertencentes ao gênero Pseudomonas também têm sido exploradas biotecnologicamente, pois produzem uma vasta gama de antimicrobianos que podem ser utilizados no controle de pragas e fitopatógenos. A partir desses fatos, uma linhagem de P. agglomerans, 33.1, previamente isolada endofiticamente de Eucalyptus grandis e promotora de crescimento dessa cultura, foi avaliada quanto aos aspectos biotecnológicos durante associação com cana-de-açúcar. A linhagem 33.1 foi capaz de promover o crescimento de cana-de-açúcar e também induziu a produção de proteínas de resistência pelas plantas inoculadas. Dentre os mecanismos avaliados na promoção de crescimento vegetal, a linhagem apresentou alta produção de fitormônio e fosfatases. Foi também confirmado que a interação planta-bactéria afetou o metabolismo da linhagem 33.1. Um plasmidio integrativo, pNKGFP, foi desenvolvido e inserido na linhagem 33.1. A linhagem bacteriana marcada foi monitorada durante interação com cana-de-açúcar. Por microscopia de fluorescência, re-isolamento e PCR quantitativo (qPCR) foi confirmada a capacidade de colonização cruzada de cana-deaçúcar pela linhagem 33.1:pNKGFP, abrindo assim precedentes para utilização dessa linhagem em outras culturas. Posteriormente, a linhagem 33.1 foi geneticamente modificada para produção da proteína Cry. Por meio de bioensaios em dieta artificial e colmos de cana-de-açucar foi provado o parcial controle de Diatraea saccharalis, uma importante praga de cana-de-açúcar, pela linhagem endofítica expressando heterologamente o gene cry1a7c. Vários antibióticos e sideróforos produzidos pela bactéria P. fluorescens, linhagem Pf-5, foram avaliados quanto ao controle de Fusarium spp., incluindo isolados de F. verticillioides causadores de Pokkah boeng em cana-deaçúcar. Por mutações sitio-dirigido em genes envolvidos na biossíntese de antimicrobianos foi provado que os compostos 2,4-diacetil-floroglucinol e rizoxina são os principais responsáveis no controle Fusarium spp. Por HPLC e RT-qPCR foi também provado que ácido fusárico afeta a produção de antibióticos pela Pf-5.Sugarcane is one of the most important Brazilian crops. Its importance is increasing due to the gradual substitution of fossil fuel for renewable and cleaner energy sources, such as ethanol Consequently, the biotechnological aspects that mediate sugarcane-bacterium interactions must be evaluated; studies from tropical countries are incipiente Bacterium-plant interactions can often improve the growth and fitness of associated plants. One of these beneficial bacteria, Pantoea agglomerans, has been isolated from many vegetal species. The Pseudomonas genus also has a record of biotechnological exploration due to its wide range of antibiotic production. These compounds can be used on pest and plant-pathogen control. For these reasons, P. agglomerans, strain 33.1, previously isolated from Eucalyptus grandis and a known eucalyptus growth-promoter, was evaluated about regarding the biotechnological aspects of sugarcane-bacterial association. 33.1 strain was able to promote sugarcane growth and also to induce the production of resistance proteins for inoculated plants. The plant-hormone and phosphatase production by 33.1 were associated with sugarcane growth-promotion bacterial mechanisms. An integrative plasmid, pNKGFP, was constructed and used to transform 33.1. The marked strain was monitored during sugarcane association. The sugarcane cross-colonization by 33.1:pNKGFP was confirmed by fluorescence microscopy, re-isolation and quantitative PCR (qPCR), suggesting that 33.1 should be used in association with other crops. 33.1 was genetically modified to produce the Cry protein. The partial biocontrol of Diatraea saccharalis, the sugarcane borer, by the endophytic strain expressing heterologously the cry1a7c gene, was confirmed in bioassays using artificial diet and sugarcane stalks. Several antibiotics and siderophores produced by P. fluorescens Pf-5 were tested against Fusarium spp.; including isolates of F. verticillioides responsible for the sugarcane Pokkah boeng disease. By deriving site-directed mutants of Pf-5, with single and multiple mutations, in the bio-synthetic gene clusters of the antifungal compounds, it was proved that 2,4-diacetyl-phoroglucinol and rhizoxin are the major compounds responsible for the Fusarium spp. suppression. The fusaric acid effects on Pf-5 antibiotic production was proved by HPLC and RT-qPCR