Stem celll therapy in experimental chronic nephropathy: is it possible to block the progression of renal disease?

Células-tronco (CT) apresentam potencial terapêutico para a doença renal pela possibilidade de regeneração tecidual e recuperação funcional, possivelmente por efeitos parácrinos. Diversos trabalhos mostraram seu efeito renoprotetor em modelo de insuficiência renal aguda. No entanto, existem poucos trabalhos que avaliaram o efeito da CT em doença renal crônica. Neste contexto, a via de inoculação e o número das CT na região da lesão podem desempenhar um papel crucial. Assim, o transplante de CT pela via EV não parece ser o mais apropriado para prover CT em número expressivo no órgão alvo. Uma técnica alternativa consiste em inocular as CT localmente, na região subcapsular renal. O objetivo do presente estudo foi analisar, em modelo experimental de doença renal crônica por nefrectomia 5/6 (Nx), a migração, a distribuição e o possível efeito renoprotetor da inoculação via subcapsular renal de 2 tipos de CT: derivadas da medula óssea (CTdmo) e mesenquimais (CTm). As CT foram coletadas de fêmur e tíbia de ratos doadores através da técnica de flushing. As CTdmo foram isoladas por gradiente de concentração e as CTm pela sua capacidade de aderência ao plástico e ambas marcadas com DAPI para a visualização no tecido. A caracterização das CT foi feita por citometria de fluxo e pela diferenciação celular in vitro. Foram realizados 2 protocolos experimentais. No protocolo I, CTdmo (1x106) foram inoculadas em ratos fêmeas e, no protocolo II, CTm (2x105) foram inoculadas em ratos machos. A região inoculada foi a subcapsula renal e os animais foram acompanhados por 15 e 30 dias. Os animais foram subdivididos nos grupos: Sham, ratos submetidos à cirurgia fictícia; Sham+CT, ratos submetidos à cirurgia fictícia que receberam CT (CTdmo ou CTm); Nx, ratos submetidos a nefrectomia 5/6; Nx+CT, Nx ratos que receberam CT (CTdmo ou CTm). Para avaliar a localização das CTdmo no tecido renal, utilizou-se a coloração de tricrômio de Masson e foi realizada uma análise semiquantitativa para avaliar o grau de infiltração. Foram analisadas a pressão arterial (PA), a albuminúria e a creatinina sérica. Para os animais que receberam CTm foi realizada a análise de parâmetros histológicos e a análise de marcadores inflamatórios, de células em atividade proliferativa, de miofibroblastos e de podócitos. Os resultados do Protocolo I avaliando a análise da infiltração no tecido renal das CTdmo marcadas com DAPI mostrou, em 5 dias, evidente infiltração das células da região subcapsular em sentido ao córtex e medula, inclusive presente em glomérulos. Ratos fêmeas Nx que receberam a inoculação das CTdmo na região da subcapsular renal não apresentaram melhora nos parâmetros que avaliaram a função renal. Protocolo II: as CTm cultivadas mostraram grande capacidade de aderência, crescimento em colônia e de diferenciação em células osteogênicas. A análise por citometria mostrou-se positiva para CD44 e CD90, com uma pequena população de células de CD34, CD45 e CD31, confirmando a presença preponderante de CTm. A inoculação de CTm em ratos Nx proporcionou um bloqueio da progressão da doença renal. Enquanto ratos Nx machos apresentaram elevada PA com 15 e 30 dias (149,6±9,1 e 191,7±2,8 mmHg) a inoculação de CTm promoveu significante redução após 30 dias (145,2±6,8 mmHg; p<0,05 vs Nx). Em ratos Nx foi observado um aumento na creatinina aos 15 e 30 dias (1,13±0,08 e 1,16±0,26 mg/dL) e a inoculação de CTm promoveu uma marcante redução aos 15 dias (0,58±0,03 mg/dL; p<0,05 vs Nx). A albuminúria foi elevada nos ratos Nx aos 15 e 30 dias (41,7±10,8 mg/24h e 138,7±33,6 mg/24h) enquanto os animais do grupo Nx+CTm aos 15 e 30 dias apresentaram diminuição significativa (4,6±1,5 mg/24h e 23,4±7,7 mg/24h; p<0,0001 vs Nx). A glomeruloesclerose do grupo Nx+CTm apresentou aos 30 dias uma redução significativa em relação ao grupo Nx (5,4±2,5% vs 22,0±6,1%, respectivamente; p<0,0001). A análise da fibrose intersticial não revelou diferença após 15 dias e 30 dias no grupo Nx+CTm em relação ao grupo Nx. Com relação ao número de macrófagos, linfócitos e de células em atividade proliferativa, os animais que receberam CTm apresentaram uma discreta diminuição de sua expressão no tecido renal. A expressão de -actina se reduziu significativamente no grupo Nx+CTm. Quanto à expressão de WT-1, específico para podócitos, os animais Nx+CTm tiveram aumento significativo da marcação em relação ao grupo Nx. Em resumo, após a inoculação de CT na região da subcapsula renal, houve marcante migração e distribuição das mesmas em direção à cortical e à medular. A inoculação de CTm proporcionou um efeito renoprotetor no modelo de nefrectomia 5/6. Sendo assim, a inoculação subcapsular renal pode representar uma importante via de inoculação, permitindo assim que um número maior de células atue na proteção da progressão da doença.Stem cells (SCs) offer therapeutic potential for the treatment of renal diseases, due to the possibility of tissue regeneration and functional recovery. Various studies have shown renoprotection by SCs in experimental models of acute kidney disease. However, only a few studies have studied their effect in chronic kidney disease. The beneficial effect of SCs seems related to their capacity to differentiate or to secrete paracrine/endocrine factors. In this context, the inoculation route or the number of SCs homing in the injured region can play a crucial role. Therefore, transplantation of MSC through the intravenous route does not seem to be best suited for delivery of an important number of cells to the target organ. An alternative technique consists in local delivery of SCs in the subcapsular region of the kidney. The objective of the present study is to analyze the migration, distribution and potential renoprotective effect of the subcapsular inoculation of two types of SC - BSMC and mesenchymal stem cell (MSC) - in an experimental model of chronic kidney disease, the 5/6 nephrectomy (Nx). SCs were collected from the femur and tibia of donor rats by flushing. BSMC were isolated by centrifugation on a concentration gradient and MSCs were isolated by their capacity to adhere to plastic. Both types of SC were stained with DAPI to allow visualization in tissues. SC characterization was carried out by flow cytometry and differentiation in culture. Two experimental procedures were performed. In protocol I, BSMC (106 cells) were injected in female rats and in protocol II, MSCs (2x105 cells) were injected in male rats. Animals were divided into 4 groups: SHAM, sham-operated rats; SHAM+SC, sham-operated rats receiving BSMC or MSCs; Nx, rats undergoing 5/6 nephrectomy; Nx+SC, 5/6 Nx rats receiving BSMC or MSCs. We used Massons Trichrome staining and a semiquantitative analysis according to the degree of infiltration to follow the localization of BSMC in the renal tissue and to quantify their infiltration, respectively. The following parameters were studied: arterial blood pressure (AP), proteinuria (Uprot), albuminuria (Ualb) and serum creatinine (Screat). For the animals receiving SCs, analysis of histology, of inflammatory markers, of proliferating cells and of podocytes was performed. Results from Protocol I assessing DAPI-stained BSMC showed marked infiltration in 5 days from the subcapsular region to the cortex and the medulla, including presence in the glomeruli, over a period of 15 days. Female rats that received subcapsular injection of BSMC did not show improvement of the parameters used to assess kidney function. Protocol II: cultured MSCs demonstrated an ability to adhere to plastic, to grow in colonies and to differentiate in osteogenic cells. Quantitative analysis of cell markers by flow cytometry showed that isolated cells were positive for CD44 and CD90, with a small population of cells positive for CD31, CD34 and CD45, confirming a preponderant presence of MSCs. Inoculation of MSCs in Nx rats blocked the progression of the renal disease. Elevated AP in Nx rats at 15 and 30 days (149.6 ± 9.1 and 191.7 ± 2.8 mm Hg, respectively) was significantly reduced by inoculation of MSCs at 30 days (145.2 ± 6.8 mm Hg, p<0.05 vs Nx). Nx rats showed increased creatinine at 15 and 30 days (1.13 ± 0.08 and 1.16 ± 0.26 mg/dL, respectively) that was significantly reduced by injection of MSCs at 15 days (0.58 ± 0.03 mg/dL, p<0.05 vs Nx). Albuminuria was increased in Nx rats at 15 and 30 days (41.7 ± 10.8 and 138.7 ± 33.6 mg/24h, respectively) and was reduced in the Nx+MSC group at both time points (4.6 ± 1.5, and 23.4 ± 7.7 mg/24h, respectively; p<0.0001 vs Nx). Histologic analysis showed that glomerulosclerosis at 30 days in the Nx+MSC group was significantly reduced as compared to the Nx group (5.4 ± 2.5 % vs 22.0 ± 6.1 %, p