Cancer Stem Cells in Human Osteosarcoma: Tracking Stemness to Target Chemoresistance

Tese de doutoramento em Engenharia Biomédica, apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de CoimbraOsteosarcoma is the most common primary malignant bone tumor, afflicting mainly young patients. Since the inception of chemotherapy, survival rates augmented significantly, but are stagnated over the past decades, due to the absence of improved therapy. Most patients succumb to metastatic disease, which can occur even after apparent successful histological response to chemotherapy that precedes the surgical removal of the primary tumor. Recently, the cancer stem cell (CSC) model has been receiving attention and suggests that stem-like cells exist in many tumor types, form the clonogenic core of the tumor and actively contribute to chemoresistance. This theory was originally postulated as a somewhat rigid hierarchical model of tumor development, in which a self-renewing CSC originates differentiated progeny and is responsible for feeding the bulk tumor mass. However, evidence suggests that diverse pools of CSCs might exist, contributing to the intratumoral heterogeneity of solid tumors, including osteosarcoma. Besides, extrinsic factors, e.g. drug exposure, may also constitute a source of stemness within the tumors. In this thesis we performed a molecular and functional characterization of CSCs in a panel of cell lines representative of two histological subtypes of high-grade osteosarcoma, and investigated the central role of the regulatory Wnt/β-catenin pathway in the stemness properties and survival advantages of CSCs. In the first part, we demonstrated that different CSCs populations may co-exist in osteosarcoma cell lines exhibiting distinct functional properties. CSCs isolated from fibroblastic tumors are slowly-proliferating populations overexpressing Sox2 and Klf4 pluripotency-related markers, have enhanced tumorigenic potential and specific activation of the self-renewal-related Wnt/β-catenin pathway, as assessed by nuclear β-catenin positivity, AXIN2 expression and TCF/LEF transcriptional activity. The Aldefluor+ populations detected in the two histological osteosarcoma subtypes are SOX2+, but KLF4-, whereas the side-population subset phenotype is correlated with ABCG2 drug-efflux transporter expression. Altogether, these results suggest that distinct functional methods identify CSCs with dissimilar characteristics, which may have implications on the design of CSC-targeted therapies. In the second part, we evaluated the therapeutic potential of inhibiting Wnt/β-catenin against chemoresistant CSCs. The Wnt signaling antagonist IWR-1 was selectively cytotoxic for CSCs, by decreasing cell viability, proliferation and cell cycle progression. IWR-1 induced apoptosis of osteosarcoma CSCs and in combination with doxorubicin treatment elicited synergistic cytotoxicity, reversing CSCs intrinsic resistance to this drug. IWR-1 impaired CSC’ self-renewal capacity by compromising landmark steps of the canonical Wnt signaling, namely nuclear β-catenin translocation and subsequent TCF/LEF activation and expression of downstream targets. Wnt inhibition also hampered Aldefluor activity and expression of key pluripotency-related genes. We observed a remarkable anti-tumor effect of IWR-1 in osteosarcoma-xenografted models that potentiated the anti-tumor efficacy of doxorubicin, accompanied by down-regulation of TCF/LEF transcriptional activity, Sox2 and AXIN2 expression and nuclear β-catenin. In the third part, we explored the striking hypothesis that drugs used in osteosarcoma treatment induce stemness properties in differentiated cells. Doxorubicin, cisplatin and methotrexate induced a phenotypic stem-like cell transition, by increasing Aldefluor activity and ALDH, ABC transporters and pluripotency markers expression. Doxorubicin up-regulated stemness markers via Wnt/β-catenin activation, but co-treatment with IWR-1 prevented the drug-induced phenotype. Altogether, these results are consistent with the ability of doxorubicin to kill rapidly-dividing cancer cells, and of IWR-1 to eliminate chemoresistant CSCs populations and overcome acquired resistance. Translational significance of this study was conveyed by the pluripotency mRNA signature found in uncultured osteosarcoma patient samples and by the correlation of stemness-related markers expression with a worst prognosis in osteosarcoma patients who responded poorly to chemotherapy (EuroBonet dataset of whole genome expression). To conclude, our results suggest the existence of phenotypic heterogeneity in osteosarcoma CSCs, and revealed the Wnt/β-catenin as a key determinant of the stemness and chemoresistant profile of osteosarcoma. Targeting the Wnt pathway may simultaneously circumvent chemoresistance and the phenotypic differentiated-to-stem like cell transition induced by chemotherapeutics, and thus contribute to reduce chemotherapy doses and ameliorate the prognostic outcomes of osteosarcoma patients.O osteossarcoma é o tumor ósseo primário maligno mais comum e afecta sobretudo jovens adolescentes. Com a introdução da quimioterapia, as taxas de sobrevivência aumentaram significativamente, mas estagnaram nas últimas décadas, devido à falta de terapias mais eficazes. Muitos doentes desenvolvem metástases e sucumbem à doença, mesmo após boa resposta histológica à quimioterapia que antecede a remoção cirúrgica do tumor primário. Recentemente, o modelo das células estaminais cancerígenas (CSCs) sugere a existência de células com propriedades estaminais que formam o núcleo clonogénico tumoral e contribuem para a quimio-resistência. Esta teoria foi inicialmente postulada como um modelo hierárquico rígido, no qual CSCs com capacidade de auto-renovação e de diferenciação sustentam o crescimento do tumor e dão origem à população heterogénea de células diferenciadas. No entanto, há evidências que sugerem a existência de diferentes subpopulações de CSCs, podendo assim contribuir para a marcada heterogeneidade intratumoral típica dos tumores sólidos, incluindo o osteossarcoma. Além disso, factores extrínsecos, como por exemplo a exposição à quimioterapia, podem também contribuir para a aquisição de um fenótipo estaminal nos tumores. No âmbito desta tese foi realizada uma caracterização molecular e funcional de CSCs num painel de linhas celulares representativas de dois subtipos histológicos de osteossarcoma de alto-grau, tendo-se investigado o papel central da via Wnt/β-catenina na regulação da estaminalidade e na sobrevivência de CSCs. Numa primeira parte, demonstrámos a existência de diferentes populações de CSCs no osteossarcoma, com propriedades funcionais distintas. As CSCs isoladas a partir de tumores fibroblásticos, caracterizam-se por uma baixa taxa de proliferação, expressão de marcadores de pluripotência (Sox2 e Klf4), elevado potencial tumorigénico e ativação da via Wnt/β-catenina, evidenciada pela localização nuclear de β-catenina, expressão da AXIN2 e actividade de transcrição do TCF/LEF. As populações Aldefluor+ detectadas nos dois subtipos histológicos de osteossarcoma, são SOX2+, mas KLF4-, enquanto o fenótipo side-population se correlaciona com a expressão do transportador de efluxo ABCG2. Estes resultados sugerem que diferentes métodos funcionais identificam CSCs com características distintas, o que pode ter implicações no desenho de terapias dirigidas às CSCs. Numa segunda parte, avaliámos o potencial terapêutico de inibição da via Wnt/β-catenina em CSCs quimio-resistentes. O inibidor IWR-1 mostrou seletividade citotóxica para as CSCs, como demonstrado pela diminuição na viabilidade, proliferação e progressão do ciclo celular e indução da apoptose. Demonstrou ainda sinergia em combinação com a doxorrubicina, revertendo a resistência intrínseca das CSCs a este fármaco. A inibição da via Wnt, demonstrada pela diminuição da translocação nuclear da β-catenina e repressão da atividade de transcrição do complexo TCF/LEF, comprometeu a capacidade de auto-renovação das CSCs e diminuiu a actividade do Aldefluor, assim como a expressão de genes de pluripotência. No modelo in vivo de osteossarcoma, o tratamento com o inibidor IWR 1 mostrou um efeito anti-tumoral pronunciado, acompanhado por uma diminuição da atividade de transcrição do TCF/LEF e da expressão de AXIN2, Sox2 e β-catenina nuclear. Na terceira parte, avaliámos os efeitos de agentes de quimioterapia utilizados no tratamento de osteossarcoma, nomeadamente a doxorrubicina, cisplatina e o metotrexato na aquisição de um fenótipo estaminal. Observou-se um aumento na atividade e expressão de ALDH, bem como da expressão de transportadores ABC e dos marcadores de pluripotência nas células expostas à quimioterapia, efeito que foi mediado pela ativação da via de sinalização Wnt/β-catenina. A inibição desta via com o IWR 1 preveniu a aquisição de um fenótipo estaminal induzido pela doxorrubicina, o que demonstra a capacidade do IWR 1 em eliminar CSCs e prevenir o desenvolvimento de resistência adquirida. O potencial translacional desta tese assenta na observação de uma potencial assinatura genética definida pela expressão de marcadores de pluripotência em amostras clínicas de osteossarcoma, e da correlação da expressão destes marcadores com um mau prognóstico, em doentes não-responsivos à quimioterapia, de acordo com a base de dados EuroBonet. Em conclusão, este trabalho sugere a existência de heterogeneidade fenotípica em CSCs de osteossarcoma e demonstrou que a via da Wnt/β-catenina constitui um fator chave associado à estaminalidade e à quimio-resistência das CSCs. O desenvolvimento de novas terapias dirigidas às CSCs, tendo como alvo a via da Wnt/β-catenina poderá contribuir para contornar a quimio-resistência intrínseca das CSCs e prevenir a aquisição de um fenótipo estaminal induzido pela exposição a fármacos. Esta abordagem poderá contribuir para reduzir as doses de quimioterapia e melhorar o prognóstico de doentes com osteossarcoma.Centro de Investigação em Meio Ambiente, Genética e Oncobiologia da Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra” (NRC-LPCC/CIMAGO Grant 2014