Deteção e quantificação de soja geneticamente modificada em alimentos por técnicas baseadas na reação em cadeia da polimerase

Dissertação de mestrado em Segurança Alimentar, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de CoimbraDesde que se iniciou o cultivo de plantas transgénicas, a soja tem sido a principal cultura a nível global. A linhagem de soja GTS 40-3-2 autorizada pela União Europeia (UE) e comercializada com o nome de soja Roundup Ready™ (RR) foi desenvolvida pela empresa Monsanto para permitir a sua tolerância ao glifosato, o ingrediente ativo do herbicida RR. Desde a entrada de organismos geneticamente modificados (OGM) na cadeia alimentar têm surgido várias preocupações, quer a nível do público em geral, quer a nível científico, relativamente à sua segurança. Por este motivo, a UE tem dedicado uma atenção especial à legislação relativa à presença de OGM, obrigando à rotulagem da presença acidental ou inevitável de OGM na proporção acima de 0,9%, por considerar necessário garantir a informação completa e fiável dos consumidores. Tal facto, torna a necessária a verificação da conformidade da rotulagem através de metodologias analíticas adequadas. Os métodos baseados no ADN, nomeadamente a reação em cadeia da polimerase (PCR), têm-se mostrado os mais adequados para a detecção e quantificação de OGM. O objetivo deste trabalho consistiu em detetar e quantificar a presença do evento RR da soja em alimentos à base de soja disponíveis no mercado, com diferentes níveis de processamento. Quatro fases experimentais foram então realizadas: (i) extração do ADN; (ii) amplificação do gene da lectina; (iii) deteção de soja RR; e (iv) Quantificação do evento soja RR. Primers específicos para o evento RR da soja foram usadas para amplificar um fragmento esperado de 103 pb utilizando materiais de referência certificados, contendo 0%, 0,1%, 1%, 5% e 10%. Para a confirmação e quantificação do evento, foi utilizada a técnica de PCR em tempo real com sondas fluorescentes de hidrólise do tipo TaqMan. A amplificação por PCR do gene de lectina da soja mostrou que foi possível obter ADN amplificável de soja em 80% das 91 amostras comerciais, apesar do elevado nível de processamento da grande maioria dos alimentos. A aplicação do ensaio de PCR em tempo real permitiu confirmar os 6 resultados positivos para a soja RR, mostrando que uma das amostras continha 21% de soja RR sem estar rotulada, enquanto as restantes apresentavam teores deste evento que variaram entre os 0,01% e os 0,39%. Assim, uma das amostras não se apresentava conforme a rotulagem obrigatória quanto à presença de OGM.Since the beginning of genetically modified organisms (GMO) cultivation, soybean has been the main crop globally. The soybean line GTS 40-3-2 was authorized by the European Union (EU) and commercialized under the name Roundup Ready™ (RR) soybean. It was developed by Monsanto to allow glyphosate tolerance, the main active ingredient of the herbicide RR. Since GMO entered the food chain, several concerns from public in general and scientific community have arisen with regard to their safety. For this reason, the EU has dedicated special attention to legislation, requiring the labeling of accidental or unavoidable presence of GMO in the ratio above 0.9%, as it considers necessary to ensure complete and reliable consumer information. This fact makes it necessary to verify the conformity of labeling through the appropriate analytical methodologies. The DNA-based methods, including the polymerase chain reaction (PCR) have shown to be the most adequate for the detection and quantification of GMO. The aim of this study was to detect and quantify the presence of RR event in soy foods available on the market, with different levels of processing. Four experimental steps were then performed: (i) DNA extraction; (ii) amplification of the lectin gene; (iii) RR soybean detection; and (iv) quantification of soybean event RR. Specific primers targeting soybean RR event were used to amplify a 103 bp fragment using certified reference materials containing 0, 0.1, 1, 5% and 10%. To confirm and quantify the event, real-time PCR using fluorescent TaqMan hydrolysis probes was applied. PCR amplification of the soybean lectin gene showed that it was possible to obtain soybean amplifiable DNA in 80% of the 91 commercial samples, despite the high level processing of most foods. The implementation of real-time PCR assay allowed confirming the 6 positive results for the presence of RR soybean, showing that one of the samples contained 21% of RR soybean without being labeled, while the remaining contents of the event ranged between 0.01% and 0.39%. Thus, one of the samples was not conform the mandatory labeling for the presence of GMO