Desenvolvimento de metodologias de biologia molecular para a deteção de Cynara scolymus e Silybum marianum em suplementos alimentares à base de plantas

Dissertação de mestrado em Segurança Alimentar, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de CoimbraAs plantas Cynara scolymus L. (Alcachofra) e a Silybum marianum (L.) Gaertn (Cardo mariano) têm sido frequentemente incluídas em suplementos alimentares devido às suas propriedades benéficas para a saúde. De acordo com a Diretiva 2002/46/CE, os suplementos alimentares são considerados alimentos, não sendo por isso sujeitos a qualquer avaliação de segurança, qualidade ou eficácia antes da sua comercialização. Esta limitação no seu controlo pode facilitar potenciais adulterações, como a troca intencional ou acidental de material vegetal. Deste modo, metodologias analíticas específicas, tais como as baseadas na análise de ADN constituem ferramentas fundamentais para a avaliação da autenticidade destes produtos. Assim, o objetivo deste trabalho consistiu na deteção de alcachofra e cardo mariano em suplementos alimentares para a perda de peso, usando as técnicas de PCR qualitativa e PCR em tempo real com análise por high resolution melting (HRM). Para tal, foram utilizadas sementes destas plantas, catalogadas por bancos de germoplasma (nacional e internacionais), e de espécies filogeneticamente próximas a estas, totalizando 43 espécies de plantas medicinais, e 17 suplementos alimentares contendo alcachofra e/ou cardo mariano. Os extratos de ADN de todas as amostras de plantas e suplementos alimentares foram amplificados por PCR qualitativa, tendo como alvo regiões nucleares (18S rRNA) e dois genes cloroplastidiais (rbcL e matK). Os primers EG-F/EG-R desenhados na região nuclear foram os que apresentaram maior universalidade e capacidade de amplificação do ADN das amostras de suplementos. A especificidade dos primers com alvo numa região genómica da C. scolymus foi testada por PCR qualitativa, verificando-se que estes permitiam a amplificação de diferentes espécies do género Cynara. A aplicação do método possibilitou a deteção de Cynara spp. em algumas das amostras de suplementos alimentares. O desenvolvimento de um sistema de PCR em tempo real com análise HRM permitiu discriminar a C. scolymus das restantes espécies, com um nível de confiança acima de 99,4% e, ainda, confirmar a presença inequívoca de C. scolymus nos suplementos testados (nível de confiança >98,8%). Para a deteção de S. marianum, conseguiu-se desenvolver um método de PCR qualitativa específico para a espécie, mas a sua aplicação não permitiu detetar a presença de cardo mariano nos suplementos alimentares analisadosCynara scolymus L. (artichoke) and Silybum marianum (L.) Gaertn (Marian thistle) are frequently included in plant food supplements (PFS), owing to their beneficial health properties. According to Directive 2002/46 / EC, food supplements are defined as foods, so they are not subject to any quality, efficacy or safety assessments prior to their commercialisation. Thus, these products are often subjected to fraudulent practices, such as the intentional or accidental exchange of plant material. To assess their authenticity, the development of reliable and specific analytical methods is of utmost importance. With this work, it was intended the development of DNA-based methods, namely qualitative polymerase chain reaction (PCR) and real-time PCR coupled with high resolution melting analysis (HRM) for the detection of C. scolymus and S. marianum in food supplements for weight loss. For this purpose, seeds from these plants and other genetically related species provided by banks cataloged germplasm (national and international), totalising 43 medicinal plants, and 17 plant food supplements, containing artichoke and/or thistle, were used in this study. DNA extracts from all samples of plants and food supplements were amplified by PCR qualitative, targeting the nuclear regions (18S rRNA) and two plastidial genes (rbcL and matK). The EG-F/EG-R primers that were designed a conserved nuclear region showed the greatest universality, enabling positive amplification of PFS. The specificity of the primers targeting the genomic region of C. scolymus was assayed by qualitative PCR, allowing the amplification of different species from Cynara genus. The application of the proposed qualitative PCR enabled the detection of Cynara spp. in some samples of PFS. The development of a real time PCR system coupled with HRM analysis allowed to discriminate C. scolymus from other species with a high level of confidence (99.4%). Using the proposed system, it was also possible to identify the presence of C. scolymus in the tested PFS (level of confidence >98.8%). For the detection of S. marianum, it was developed a species-specific qualitative PCR method, but its application did not allow detecting the presence of thistle in the PFS under study