Adjuvant Nanocarriers for Hepatitis B Vaccine: Formulation Design and Mechanistic Studies

Tese de doutoramento em Ciências Farmacêuticas, na especialidade de Tecnologia Farmacêutica, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de CoimbraA vacinação tem um papel essencial na área da saúde pública e um enorme impacto na sociedade moderna. O desenvolvimento de formulações mais seguras tem levado a que a investigação de vacinas baseadas em microorganismos vivos inativados ou mortos seja preterida em prol da utilização de pequenas proteínas ou de outras moléculas contendo epítopos antigénicos, cuja imunogenicidade é reduzida. Contudo, o sucesso dessas vacinas depende da presença de adjuvantes imunológicos, por forma a aumentar a resposta imune gerada. Ao longo dos últimos anos diversas nanoparticulas (NPs) políméricas têm sido estudadas como sistemas adjuvantes de vacinas, funcionando como sistemas de entrega, protegendo os antigénios e aumentando o reconhecimento e internalização destes por parte de células especializadas do sistema imunológico. Face ao exposto, o objetivo do trabalho subjacente à presente dissertação consistiu na preparação e avaliação de NPs poliméricas de poli-caprolactona (PCL) e quitosano como adjuvantes de uma vacina para a hepatite B. As NPs preparadas através do método de nanoprecipitação foram pormenorizadamente caracterizadas e as suas capacidades como adjuvantes avaliadas através de ensaios in vitro e in vivo. Quando suspensas em água, as NPs apresentaram um tamanho aproximado de 200 nm e um potencial zeta positivo (+ 25 mV). Estas NPs, constituídas pela mistura física dos dois polímeros, revelaram citocompatibilidade com diversas linhas celulares e células primárias, boa interação e internalização celular. A presença de quitosano na superfície das NPs maioritariamente constituídas por PCL, permitiu obter partículas com uma elevada capacidade de carregamento de proteínas modelo e de plasmídeos através de adsorção à superfície. Usando células mononucleares isoladas a partir de sangue periférico humano, demonstrou-se que estas NPs não induzem a secreção do fator de necrose tumoral alfa (TNF-), uma citocina ligada a reações inflamatórias, que, por vezes, está também na base do mecanismo de ação de alguns adjuvantes. Por outro lado, descobriu-se que as NPs de PCL/quitosano são ativadoras de mastócitos. A ativação destas células leva à sua desgranulação, favorecendo a libertação de mediadores imunológicos que tem um papel activo na geração da resposta imune. Ambas as descobertas foram importantes contribuições sobre o mecanismo adjuvante das NPs de PCL/quitosano. Neste trabalho, estudos de vacinação de murganhos C57BL/6 permitiram validar, pela primeira vez, a aplicação das NPs de PCL/quitosano como um sistema adjuvante na vacinação contra a infeção pelo vírus da hepatite B. Inicialmente, testou-se uma vacina de ADN, na qual o plasmídeo codificado para a expressão do antigénio de superfície do vírus da hepatite B (HBsAg) foi adsorvido à superfície das NPs. No entanto, a resposta imune obtida com esta abordagem foi negligível. Por sua vez, asformulações desenvolvidas com a proteína recombinante HBsAg adsorvida à superfície das NPs levaram a uma forte resposta humoral quando administradas pela via subcutânea, superior à resposta gerada pela vacinação com a vacina comercial Engerix-B®, na mesma dose. A reposta gerada foi dependente da dose de NPs administrada, sendo que doses mais elevadas deste adjuvante nanoparticulado geraram um aumento estatísticamente significativo na produção de citocinas secretadas por linfócitos do tipo Th1 e Th17. Numa outra abordagem, foram ainda usados exosomas, adjuvantes imunológicos ainda pouco explorados para vacinas baseadas em proteínas recombinantes, mas cujas propriedades têm revelado vantagens em estratégias de vacinação contra tumores. Os resultados da vacinação subcutânea com exosomas como adjuvantes da formulação de NPs adsorvida com o HBsAg, demonstraram o aumento da resposta imune inata in vivo, ilustrada pelos níveis basais elevados de interferão gama (IFN-) secretado por esplenócitos. No entanto, a utilização desta formulação não se mostrou vantajosa na resposta imune específica. Por fim, realizaram-se estudos de vacinação pela via nasal encorajados pelos bons resultados da vacinação subcutânea e pela capacidade que as NPs demonstraram de adsorverem mucina, uma glicoproteína abundante no muco e de ficarem retidas sobre uma camada artificial de muco produzida in vitro. Estes estudos mostraram a possibilidade da utilização das NPs de PCL/quitosano para vacinação nasal contra a hepatite B, utilizando quantidades muito reduzidas de antigénio. Em suma, ao longo dos trabalhos realizados no âmbito da presente tese de doutoramento, foi possível caracterizar e testar com sucesso as NPs de PCL/quitosano como adjuvantes da vacinação, quer pelo efeito de transporte, quer pelo efeito imunoestimulante. Apesar da extrapolação dos resultados entre antigénios recombinantes apresentar limitações, as conclusões inferidas ao longo dos estudos são de grande importância para futuras aplicações deste sistema polimérico.Vaccination is a major achievement in global public health, with a huge impact on modern society. The development of safer formulations has instigated the use of small proteins and other molecules containing antigenic epitopes instead of the inactivated or killed microorganisms. Those antigens have reduced immunogenicity and their efficacy is dependent on the presence of immunological adjuvants. Over the last years, different polymeric nanoparticles (NPs) have been tested as vaccine adjuvants acting as delivery systems, which protect and enhance the recognition of the antigen and its internalization by the specialized immune system cells. Given the aforementioned considerations, the studies underlying the present dissertation aimed at preparing and evaluating polymeric NPs, based on poly-caprolactone (PCL) and chitosan, as adjuvants for hepatitis B vaccine. PCL/chitosan NPs, prepared by a nanoprecipitation technique, were characterized and their capabilities as a vaccine adjuvant tested through in vitro and in vivo assays. When suspended in water, NPs measured approximately 200 nm and presented a positive zeta potential (+ 25 mV). These NPs, constituted by the physical blend of two polymers, demonstrated to be cytocompatible with various cell lines and primary cells and revealed a good cellular interaction and internalization. The presence of chitosan on the surface of the NPs mainly constituted by PCL, yielded particles with a high loading capacity for model proteins and DNA plasmids through surface adsorption. Using mononuclear cells isolated from human peripheral blood, it was possible to demonstrate that PCL/chitosan NPs did not induce TNF- secretion, a cytokine linked to inflammatory response and sometimes related to adjuvants mechanism of action. On the other hand, it was observed that PCL/chitosan NPs are mast cell activators. By inducing the activation, NPs contribute to mast cell degranulation, favoring the release of immune mediators with an active role in the generation of a protective immune response. These discoveries are important contributions to the knowledge of the PCL/chitosan NPs adjuvant mechanism. Vaccination studies were performed in C57BL/6 mice, allowing for the first time, the validation of PCL/chitosan NPs as an adjuvant for a vaccine against hepatitis B virus. One of the approaches considered was the development of a DNA vaccine, in which a plasmid encoding for the hepatitis B surface antigen (HBsAg) recombinant protein was adsorbed on the surface of the PCL/chitosan NPs. However, this approach conducted to a negligible immune response. On the other hand, a formulation developed with the recombinant HBsAg protein adsorbed on NPs surface led to a strong humoral immune response when administered subcutaneously, superior to the response generated by vaccination with the commercial vaccine Engerix-B®, at the same dose. It was also found that the response generated was dependent on the NPs dose since highest doses of the adjuvant caused a significant increase in the production of cytokines secreted by Th1 and Th17 lymphocytes. In another strategy, exosomes were used as co-adjuvants of the nanoparticulate formulation vaccine. In the literature, exosomes are described as effective immunological adjuvants for tumor vaccination strategies but they are not yet widely explored as vaccine adjuvants for recombinant antigens. The study developed in this thesis demonstrated an increase in mice innate immune response after subcutaneous vaccination with the formulation co-adjuvanted with exosomes, as illustrated by the high production of basal IFN-from splenocytes. However, this formulation showed no advantage in the specific immune response. Finally, vaccination studies through the nasal route were developed, encouraged by the good results of the subcutaneous immunization, together with the results demonstrating the ability of this NPs to adsorb mucin, an abundant glycoprotein in the mucus, and to be retained in an artificial mucus layer produced in vitro. The results showed the possibility of using PCL/chitosan NPs for nasal vaccination against hepatitis B using very small amounts of antigen. Overall, with the work herein developed and described, it was possible to characterize PCL/chitosan NPs and test their ability as a delivery system and immunostimulatory adjuvant for vaccination purposes. Despite the extrapolation of these results to other recombinant antigens presents some limitations, the conclusions drawn here are of great importance for future applications of PCL/chitosan NPs.FCT - SFRH/BD/81350/201