Mechanisms underlying metabolic shift in pluripotent stem cells: The potential role of sirtuins

Tese de doutoramento em Biologia Experimental e Biomedicina, no ramo de Biologia Molecular, Celular e do Desenvolvimento, apresentada ao Instituto de Investigação Interdisciplinar da Universidade de CoimbraDe forma semelhante ao botão embrionário do blastocisto, as célula estaminais embrionárias possuem a capacidade de contínua autorrenovação e de diferenciação nos três folhetos germinativos e em todos os tipos celulares constituintes de um indivíduo adulto. Por conseguinte, as células estaminais embrionárias possuem um futuro promissor a nível de medicina regenerativa, modelos de estudo de doença in vitro, assim como uma poderosa ferramenta para a descoberta de novos fármacos e estudos fármaco-toxicológicos. Na última década, ocorreu um aumento exponencial do conhecimento relativo à biologia das células estaminais embrionárias, a nível epigenómico, trasncriptómico, proteómico e metabolómio, estimulando um melhor e correto uso para estas células. No entanto, muitos elementos desta regulação são ainda desconhecidos, o que explica o porquê de todo o potencial associado às células estaminais embrionárias ainda não ter sido alcançado. O estudo das sirtuinas ganhou um papel de destaque após a descoberta de que estas proteínas em leveduras, nemátodes e moscas têm um papel na longevidade e envelhecimento. Para além do seu papel da regulação da transcrição, as sirtuinas têm sido referidas como moduladores de muitos outros processos celulares, nomeadamente do metabolismo. Nesta tese esperámos estudar o possível papel das sirtuinas na pluripotência das células estaminais embrionárias, assim como na sua capacidade de diferenciação, dando um foco especial na influência das sirtuinas no estado metabólico da célula. Para desvendar o papel da sirtuina 1, tomamos partido de um modelo genético de células estaminais embrionárias com deleção da sirtuina 1. Comparadas às células da linha celular normal, as células estaminais embrionárias com deleção da sirtuina 1 estão mais predispostas à diferenciação espontânea, mesmo quando são cultivadas em condições de manutenção de pluripotência. No entanto, este potencial aparenta estar já enviesado, uma vez que quando sujeitas a um protocolo de diferenciação dirigido, estas células são menos eficientes a diferenciar em linhagens neuronais comparando com as células normais. Propomos que a capacidade metabólica das células poderá estar a ajudar a enviesar a capacidade de diferenciação, uma vez que as células estaminais embrionárias com deleção da sirtuina 1 têm um metabolismo glicolítico mais pronunciado em detrimento do metabolismo oxidativo comparando com as células normais. STAT3 (transdutor de sinal e activador da transcrição 3) é um factor de transcrição necessário para as vias de sinalização em pluripotência, mas também uma peça necessária para o metabolismo mitocondrial, que poderá estar envolvido nestas transições pluripotência/diferenciação e glicólise/metabolismo oxidativo das células sem sirtuina 1. Na segunda parte, foi usada uma abordagem farmacológica com o intuito de modular a expressão e atividade da Sirtuina 3. Com esse propósito, usamos o flavonoide natural kaempferol, que tem sido descrito como possuindo capacidades antioxidantes. Apesar de não ter sido possível modular a Sirtuina 3 no nosso modelo, observámos que o kaempferol poderá modular de forma distinta as propriedades das células estaminais embrionárias. Baixas concentrações aparentemente têm efeito potenciador de pluripotência, enquanto que altas concentrações não afetam a pluripotência, mas induzem morte celular, o que poderá estar associado a um aumento dos níveis da espécie reativa de oxigénio, anião superóxido. Esta parte do trabalho, embora demonstrando a falta de modulação da sirtuina 3, sugere que os compostos naturais, como o kaempferol, possam vir a ser usados em cultura para a modulação in vitro da pluripotência e do potencial de diferenciação, evitando o uso de compostos químicos não naturais nem fisiológicos. No cômputo geral, com os estudos aqui apresentados nesta tese, esperamos estar a contribuir para o conhecimento atual no plano das células estaminais embrionárias. Ademais, este trabalho permitiu salientar novos indícios sobre o papel da sirtuina 1 na regulação da pluripotência através de uma modulação (também) metabólica.Similarly to the inner cell mass of a blastocyst, embryonic stem cells have the capacity of continuous self-renewal and to differentiate into all the three germ layers and all cell types that compose an adult individual. Thus, embryonic stem cells hold a promising future for regenerative medicine purposes, in vitro disease modeling, as well as a powerful tool for drug discovery and (pharmaco-) toxicological studies. In the last decade, there was an exponential growth of knowledge regarding embryonic stem cell biology, such as in the fields of epigenomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics, inciting a better and proper use of these cells. Nonetheless, many elements of regulation are still unclear which explains why the full potential of embryonic stem cells has not yet been reached. A highlight on the sirtuins field arose after reports suggesting a role for these proteins in yeast, nematode and fly homologues in longevity and aging control. Besides their role on transcription control, sirtuins have been reported as modulators of several other cellular processes, namely metabolism. In this thesis we aimed to study the potential role of sirtuins in embryonic stem cells pluripotency, as well in their differentiation potential, with a particular focus on the potential influence of sirtuins on embryonic stem cell metabolic status. To unveil the role of sirtuin 1, we took advantage of a genetic Sirt1 knockout embryonic stem cell line. Compared to the wild-type cell line, sirtuin knockout embryonic stem cells are more prone for spontaneous differentiation, even in pluripotency culture conditions. Nonetheless, this potential appears to be biased, given that when subjected to a lineage-directed differentiation protocol, they differentiate less efficiently in neuronal cell lineages than their wild-type counterparts. We reason that the metabolic capacity of these cells may be driving this biased differentiation capacity, once sirtuin 1 knockout embryonic stem cells have a more pronounced glycolytic metabolism in detriment of oxidative metabolism when compared to wild-type cells. STAT3 (Signal Transducer and Activator of Transcription 3) is a transcription factor required for pluripotency signaling pathways, but also an instrumental player for mitochondrial metabolism, that could be involved in these pluripotency-differentiation and glycolysis-oxidative phosphorylation switches of cells lacking sirtuin 1. In a second part of this thesis, a pharmacological approach was used with the intent to modulate sirtuin 3 expression and activity. For such purpose, we used the natural flavonoid kaempferol, which has been described to have anti-oxidant capacity. Although we were not able to modulate sirtuin 3 in our model, we observed that kaempferol could distinctly modulate embryonic stem cell properties. Lower concentrations of this flavonoid act as pluripotency enhancer, while higher concentrations do not affect pluripotency, but instead induce cell death, which can possibly be associated with increased levels of the mitochondrial reactive oxygen species superoxide anion. This part of the work, although ineffective in terms of sirtuin 3 modulation, suggests that natural compounds, such as kaempferol, could be used for in vitro modulation of stem cell pluripotency and differentiation potential, avoiding the use of non-natural and non-physiological chemical factors in culture conditions. Overall, with the studies presented in this thesis we are confidently giving more insights for the current knowledge in the field of embryonic stem cells. Moreover, we reveal some new clues for the role of suirtuin 1 on the regulation of pluripotency through (also) metabolic modulation.FCT - SFRH/BD/51681/201