Uncovering the neuroprotective role of adenosine in diabetic retinopathy : alterations in the adenosinergic system

Dissertação de mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de CoimbraDiabetic retinopathy is the main cause of blindness in adults, and exhibits characteristics of chronic inflammation, such as microglia activation and release of inflammatory mediators. If microglia activation and pro-inflammatory mediator release could be inhibited, the effects of diabetes on vision loss could be reduced. Microglia, cells from the immune system, express all four types of adenosine receptors (A1, A2A, A2B, A3), a purine nucleoside with a marked effect on inflammatory situations. Adenosine is released under adverse conditions, and activation of its receptors decrease the expression and release of pro-inflammatory cytokines. Unlike other tissues, in the retina it is still unknown what effect diabetes/hyperglycemia exerts on the adenosinergic system. Therefore, in this work we have aimed to uncover the effects of diabetes on the adenosinergic system in the retina. We focused our attention on the effect diabetes or hyperglycemia, considered the main cause of diabetes complications, has on the adenosine receptor total protein levels, the main conveyors of adenosine signaling and regulation, and on the protein levels and activity of adenosine deaminase (ADA), one of the enzymes responsible for adenosine removal from the extracellular space. We used as experimental models cultures of retinal cells isolated from 3-5 days newborn Wistar rats subjected to hyperglycemic conditions, and whole retinas isolated from control or diabetic rats. These diabetic animals were obtained after intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ), which destroys pancreatic β-cells (type I diabetes mellitus model). We then analyzed the samples with Western Blot technique to assess the total protein levels. Our findings showed diabetes does affect the adenosinergic system in the retina: A1AR, A2AAR, A3AR and ADA all had their protein levels altered by diabetic conditions; for A3AR and ADA significant alterations occurred only on the retina of diabetic animals, while A1AR and A2AAR levels were altered in both cell cultures and animals.We also investigated the enzymatic activity of ADA under hyperglycemic conditions in retinal cell cultures, and revealed a strong down-regulation of ADA’s ability to deaminate adenosine in those conditions. Finally, viability assays were performed with one A2AAR agonist, CGS 21680, and one A2AAR antagonist, SCH 58261, in retinal cell cultures subjected to a hyperglycemic environment to uncover the possible role of A2AAR in the diabetic retina, and the outcome of A2AAR altered levels in diabetic conditions. The treatment with CGS 21680 did prevent the retinal cell death occurring in high glucose conditions, while the treatment with SCH 58261 aggravated it. Overall, this work shows that the retinal adenosinergic system is affected by diabetes/hyperglycemia. The effect on other adenosinergic system components will be necessary to finally understand the role of this system in diabetic retinopathy, and possibly open a new therapeutic window for the treatment of diabetic retinopathy in its early stages.A retinopatia diabética é a causa principal de cegueira em adultos, e exibe características típicas de inflamação crónica, como activação de microglias e libertação de mediadores inflamatórios. Se a activação de microglias e a libertação de factores pro-inflamatórios pudesse ser inibida, os efeitos da diabetes na visão poderiam ser reduzidos. As microglias, células do sistema imunitário, expressam todos os quatro tipos de receptores de adenosina (A1, A2A, A2B, A3), um nucleósido de purina com um efeito marcante em situações de inflamação. A adenosina é libertada em condições adversas, e a activação dos seus receptores diminui a expressão e libertação de citocinas pro-inflamatórias. Mas ao contrário de outros tecidos, na retina ainda não são conhecidos os efeitos que a diabetes/hiperglicémia causa no sistema adenosinérgico. Desta forma, neste trabalho o nosso objectivo foi o de investigar os efeitos provocados pela diabetes no sistema adenosinérgico da retina. Focámos a nossa atenção no efeito que a diabetes ou hiperglicémia, considerada como a principal causa das complicações associadas à diabetes, tem nos níveis proteicos totais dos receptores de adenosina, os principais transmissores da sinalização e regulação comandadas por este nucleósido, e nos níveis proteicos e de actividade da adenosina deaminase (ADA), uma das enzimas responsáveis pela redução da adenosina do espaço extracelular. Usámos como modelos experimentais culturas de células da retina isoladas de ratos Wistar recém-nascidos, com 3-5 dias, sujeitos a condições de hiperglicémia, e retinas isoladas de ratos controlo ou diabéticos. Estes animais diabéticos foram obtidos após uma injecção intraperitonial de estreptozotocina (STZ), que destrói as células β-pancreáticas (modelo de diabetes mellitus tipo I). Analisámos então as amostras recorrendo à técnica Western Blot para determinar os níveis proteicos totais. Os nossos resultados mostram que a diabetes afecta de facto o sistema adenosinérgico na retina: os níveis proteicos de A1AR, A2AAR, A3AR e ADA revelaram alterações provocadas pelas condições diabéticas; asalterações significativas nos níveis de A3AR e ADA ocorreram apenas na retina de animais diabéticos, enquanto que os níveis proteicos de A1AR e A2AAR foram alterados tanto em retinas de animais diabéticos, como nas culturas de células da retina sujeitas a condições de hiperglicémia. Também investigámos os níveis de actividade enzimática de ADA em culturas de células da retina sujeitas a condições de hiperglicémia, e revelámos uma forte diminuição da capacidade de ADA para degradar adenosina nessas condições. Por fim, ensaios de viabilidade celular foram efectuados com CGS 21680, um agonista de A2AAR, e SCH 58261, um antagonista de A2AAR, em culturas de células da retina sujeitas a condições de hiperglicémia, para desvendar um possível papel de A2AAR na retina diabética, e as consequências dos níveis alterados de A2AAR em condições diabéticas. O tratamento com CGS 21680 foi bem sucedido a prevenir a elevada morte de células da retina que ocorre em situações de hiperglicémia, enquanto o tratamento com SCH 58261 agravou a morte celular nessas mesmas condições. Em resumo, este trabalho mostra que o sistema adenosinérgico na retina é afectado pela diabetes/hiperglicémia. Saber o efeito que a diabetes provoca em outros componentes do sistema adenosinérgico será necessário para verdadeiramente compreender o papel deste sistema na retinopatia diabética, e possivelmente expor uma nova vertente para o tratamento da retinopatia diabética nos seus estágios iniciais