Characterization of the involvement of cancer stem cells in gastric cancer resistance to chemotherapy

Dissertação de mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de CoimbraO cancro gástrico continua a ser o segundo tipo de cancro mais mortal em todo o mundo. Apesar do crescente conhecimento sobre a tumorigénese gástrica o tratamento de doentes com cancro gástrico não melhorou significativamente. O desenvolvimento de novas abordagens para ultrapassar a resistência intrínseca e as resistência adquirida pelas células tumorais gástricas às opções terapêuticas actualmente disponíveis, constitui o maior desafio na investigação do cancro gástrico. Estudos recentes sugerem que, a resistência às terapias actualmente utilizadas no tratamento do cancro gástrico é consequência de um número reduzido de células, com capacidade de iniciação, progressão e metastização de tumores. Esta subpopulação celular formada por células estaminais tumorais (CSCs), assim chamadas devido à sua capacidade de auto-regeneração e diferenciação, características que são idênticas às das células estaminais. A acumulação de alterações genéticas e epigenéticas em células estaminais ou em células directamente delas derivadas pode levar a uma transformação maligna, originando CSCs. Além disso, pensa-se que subpopulações de CSCs desempenham um papel relevante na resistência do cancro à quimioterapia devido a uma expressão anormal de proteínas específicas. Contundo, ainda está por esclarecer a biologia destas células e o seu potencial como alvos nas estratégias terapêuticas do cancro gástrico. O principal objectivo deste trabalho foi avaliar se as subpopulações de células estaminais tumorais gástricas estão envolvidas na resistência do cancro gástrico aos fármacos utilizados actualmente na quimioterapia, e também, tentar identificar mecanismos moleculares que pudessem estar envolvidos na quimio-resistência das células estaminais tumorais gástricas. Para tal, a estratégia adoptada consistiu na utilização de diferentes linhas celulares gástricas, a partir das quais se isolaram aspotenciais subpopulações de CSCs, com base na expressão do marcador membranar CD44. As duas subpopulações obtidas, assim como a população WT foram expostas a agentes quimioterapêuticos usados regularmente no tratamento do cancro gástrico, nomeadamente a cisplatina e 5-Fluoruracil (5-FU). A partir de ensaios de citotoxicidade, o valor de GI50 foi determinado para cada droga em cada linha e em cada subpopulação. Neste trabalho foi ainda efectuada uma caracterização de proteínas envolvidas em cascatas apoptóticas nas linhas parentais, assim como nas subpopulações, com o objectivo de clarificar o potencial envolvimento deste mecanismo no fenótipo quimio-resistente destas células. Os resultados obtidos demonstraram a presença de potenciais CSCs em ambas as linhas celulares estudadas (AGS e MKN45. As linhas apresentaram níveis diferentes de resistência à cisplatina. Sendo, a linha com menor percentagem de CSCs (CD44+), a AGS, a que apresentou uma maior resistência à cisplatina. Verificou-se, também, que a subpopulação enriquecida em CSCs gástricas não apresentava uma maior resistência às drogas testadas. O envolvimento de uma sobre-expressão de proteínas anti-apoptóticas ou uma sub-expressão de proteínas pró-apoptóticas também não pôde ser correlacionado com os perfis de quimio-resistência da linha AGS WT e das subpopulações CD44+ e CD44-. Considerando os resultados obtidos, tornam-se necessários futuros estudos complementares, de modo a provar que o CD44 é um bom marcador de CSCs gástricas, e que esta subpopulação está envolvida na resistência do cancro gástrico à quimioterapia.Gastric cancer stands as the second most common cause of cancer death worldwide. Despite the increasing knowledge about the model of gastric tumourigenesis, the clinical management of gastric cancer patients has not improved significantly. The development of new approaches to overcome intrinsic and acquired resistance of gastric tumour cells, to currently available therapeutic options, constitutes a major challenge for gastric cancer research. Recent studies suggest that a small group of cells, with the ability to initiate, progress and metastasize tumours are responsible for the resistance to current therapies in gastric cancer. This subpopulations of cancer cells was named cancer stem cells (CSCs), due to their ability to self-renew and to differentiate, specific characteristics for the stem cells. Accumulation of genetic and epigenetic alterations in putative gastric stem cells or their early progenies may trigger their malignant transformation into CSCs. The subpopulations of gastric CSCs are also believed to be relevant players in tumour chemoresistance due to the abnormal expression of specific proteins. However, remains, to be fully understood the biology of these CSCs, and their potential to be used as elective targets for therapeutic strategies in gastric cancer management. The major question addressed in this work was whether gastric CSCs are involved in gastric cancer resistance to currently available drugs, and also trying to identify molecular mechanisms involved in chemoresistance of gastric CSCs. The adopted research strategy was the use of different gastric cancer cell lines, from which putative subpopulations of gastric CSCs were isolated, based on the expression of the CD44 surface marker. The isolated stem and non-stem subpopulations, as well as the WT population were exposed to drugs, currently used in gastric cancer chemotherapy,namely cisplatin and 5-Fluorouracil (5-FU). From these cytotoxicity assays, the GI50 value was determined for each drug in each cell lines and subpopulations. Characterization of some proteins involved in apoptotic cascades was also performed in stem and non-stem subpopulations, in order to clarify the potential involvement of these mechanisms in a chemoresistance phenotype. The obtained results showed the presence of potential CSCs in both cell lines in study (AGS and MKN45) expressing CD44, and these cell lines presented a significant difference in the resistance to cisplatin. Interestingly, the cell line with the lower percentage of putative CSCs, the AGS, was the one that presented a higher resistance to cisplatin. Also, the subpopulation enriched in gastric CSCs (CD44+) did not show a significantly higher resistance to the tested drugs. The involvement of an overexpression of anti-apoptotic or an underexpression of pro-apoptotic proteins couldn‟t be also correlated to the differences in the chemoresistance profiles between AGS WT, CD44+ and CD44- subpopulations, among each other. Considering all the obtained results, further studies are necessary in order to consider CD44 as a robust marker of gastric CSCs and the involvement of this subpopulation in gastric cancer resistance to chemotherapy also needs an extensive evaluation