The Adenosinergic System in the Context of Diabetic Retinopathy: From Alterations to Modulation

Tese de doutoramento em Biologia Experimental e Biomedicina, no ramo de Neurociências e Doença, apresentada ao Instituto de Investigação Interdisciplinar da Universidade de CoimbraA retinopatia diabética é uma das complicações mais comuns da diabetes e a principal causa de cegueira em adultos. Os estádios iniciais da retinopatia diabética exibem características típicas de um ambiente excitotóxico e de inflamação crónica, como a libertação excessiva de glutamato, a ativação de microglias e a libertação de mediadores inflamatórios. A adenosina é um nucleósido de purina que é libertado em condições adversas e que pode ativar quatro tipos de recetores de adenosina (A1R, A2AR, A2BR e A3R). Todos estes recetores se encontram presentes na retina e a sua ativação regula tanto mecanismos de neurotransmissão, como processos inflamatórios. Estudos mostram que vários componentes do sistema adenosinérgico são afetados por condições diabéticas em vários tecidos e modelos animais mas, mesmo com algum progresso feito, a influência que as condições diabéticas exercem neste sistema na retina ainda é pouco compreendida. Devido a isto, um dos objetivos deste trabalho foi o de esclarecer os efeitos que a diabetes causa ao sistema adenosinérgico na retina. Usámos culturas primárias de células da retina expostas a glicose elevada, para mimetizar condições de hiperglicemia característica da diabetes, e ratos tornados diabéticos por aplicação de estreptozotocina (modelo de diabetes tipo 1), como modelos para estudar o efeito que estas condições exercem nos níveis de expressão de recetores de adenosina, de transportadores de nucleósidos e de enzimas chave na remoção de adenosina como ADA e AK. Para além disso, avaliámos os níveis de atividade das NTPDases e da 5’-NT, enzimas responsáveis pela cadeia de degradação de purinas, e também os níveis de adenosina em condições de alta glicose. Também explorámos uma ligação entre ADA e DPP4 quando a glicose se encontra elevada.Demonstrámos que a expressão dos recetores A1R, A2AR e A3R está alterada em células da retina quando expostas a elevada concentração de glicose, e também em retinas de ratos diabéticos. O transportador de nucleósidos equilibrativo 1 tem expressão aumentada em condições de alta glicose, enquanto que o transportador concentrativo 2 está elevado em retinas após quatro semanas de diabetes. As enzimas de remoção de adenosina apresentam expressão diminuída em retinas após quatro semanas de diabetes, ao passo que a atividade das NTPDases aumenta com glicose elevada, assim como aumentam os níveis de adenosina extracelular. De igual modo demonstrámos que DPP4 é capaz de influenciar não só a atividade da ADA, como os níveis proteicos desta enzima, um efeito apenas parcialmente bloqueado por um inibidor da atividade enzimática da DPP4. Uma vez que o ambiente característico dos estádios iniciais da retinopatia diabética inclui várias condições moduláveis pela sinalização por adenosina, como excitotoxicidade, inflamação e angiogénese, é provável que os diferentes recetores de adenosina possam ser um potencial alvo terapêutico para o tratamento da retinopatia diabética. Devido a isto, procurámos avaliar os efeitos que a modulação do sistema adenosinérgico poderá ter na morte celular que acompanha as condições de alta glicose, e contra a neurodegeneração e perda de função que anuncia a retinopatia diabética. Avaliámos a modulação da atividade dos A1R e A2AR, assim como o bloqueio do ENT1, em culturas de células de retina sujeitas a glicose elevada. Para além disso, um antagonista do A2AR foi administrado a ratos e o desempenho da retina avaliado por eletrorretinografia, os níveis de morte neuronal avaliados por quantificação da perda de células ganglionares da retina, e as condições de inflamação avaliadas através da medição dos níveis de expressão das citocinas pró-inflamatórias TNF e IL-1β. Observámos que a ativação do A1R foi capaz de prevenir o aumento de morte celular induzido por glicose elevada, e que o bloqueio do A2AR, assim como do transporte por ENT1, provou ser igualmente eficaz na prevenção da morte celular nas mesmascondições. Para além disso, um tratamento de sete dias em ratos diabéticos com um antagonista do A2AR demonstrou um potencial efeito benéfico contra a disfunção da retina causada por diabetes, com melhorias observadas na amplitude da onda b escotópica e na latência dos potenciais oscilatórios. O bloqueio do A2AR foi igualmente benéfico contra morte neuronal, ao melhorar os níveis de sobrevivência das células ganglionares da retina em ratos diabéticos tratados. Em resumo, este trabalho mostra que o sistema adenosinérgico da retina sofre alterações na maioria dos seus componentes em condições de alta glicose e nas retinas de ratos diabéticos. De igual modo demonstrámos que a modulação da sinalização por adenosina melhora a sobrevivência de células da retina em situações de glicose elevada ou de diabetes, prevenindo também algumas respostas eletrofisiológicas anormais observadas nas retinas diabéticas, sugerindo assim que a modulação da atividade do A2AR poderá constituir uma nova estratégia farmacológica no tratamento da retinopatia diabética nos seus estádios iniciais.Diabetic retinopathy is one of the most common complications of diabetes and the leading cause of blindness in working age adults. The early stages of diabetic retinopathy exhibit characteristics of an excitotoxic environment and chronic inflammation, such as excessive glutamate release, microglia activation and release and accumulation of pro-inflammatory mediators. Adenosine is a purine nucleoside that can be released under adverse conditions, and can activate four types of adenosine receptors (A1R, A2AR, A2BR, and A3R). All four receptors are present in the retina, and its activation regulates both mechanisms of neurotransmission and inflammatory processes. Previous studies using different models have shown that several components of the adenosinergic system are affected by diabetic conditions in several tissues but, despite some progress made, the influence that diabetic conditions exert on this system in the retina is still poorly understood. Because of this, a major objective of this work was to uncover the effects of diabetes on the adenosinergic system in the retina. We used primary cultures of mixed retinal cells exposed to elevated glucose, to mimic hyperglycemic conditions, and streptozotocin-induced diabetes (one and four weeks duration) in Wistar rats (type 1 diabetes model), two models used to study the effect exerted by hyperglycemic conditions on the expression levels of adenosine receptors, nucleoside transporters, and of key metabolizing enzymes for the removal of adenosine, such as adenosine deaminase (ADA) and adenosine kinase. We also evaluated the activity levels of NTPDases and of 5’-NT, enzymes responsible for the degradation of ATP, ADP and AMP, as well as the total levels of adenosine under high glucose conditions. We also explored the interaction and influence that DPP4 has on ADA when glucose is elevated.We have shown that the expression of adenosine receptors A1R and A2AR, as well as the equilibrative nucleoside transporter 1, are altered in retinal cells exposed to high glucose. Elevated glucose increased the activity of NTPDases, along with extracellular adenosine levels. We also found that DPP4 is able to modulate ADA activity and also affect ADA protein levels, an effect that was only partially abolished by a DPP4 inhibitor. In diabetic retinas at one and four weeks of diabetes, the expression of A1R, A2AR and A3R is altered, while the concentrative transporter 2 increased, and the adenosine removing enzymes (ADA and AK) decreased after four weeks of diabetes. Elevated glucose also increased the activity of NTPDases, along with the extracellular adenosine levels. We also found that DPP4 is able to modulate ADA activity and also affect ADA protein levels, an effect that was only partially abolished by a DPP4 inhibitor. Because several conditions characteristic of the microenvironment of the early stages of diabetic retinopathy are affected by adenosine signaling, such as excitotoxicity and inflammation, it is conceivable to consider adenosine receptors as potential therapeutic targets. Because of this, we evaluated how modulation of the adenosinergic system could be protective against retinal cell death triggered by exposure to elevated glucose and against neurodegeneration and impaired retinal physiology in the diabetic retina. We assessed the modulation of A1R and A2AR activity, as well as the inhibition of ENT1 transport, on retinal cell cultures exposed to high glucose. Beyond that, an A2AR antagonist, SCH 58261, was administered to control and diabetic rats, and the retinal function assessed by performing ERG recordings. Retinal ganglion cell loss was quantified and inflammatory processes studied, by evaluating the expression of proinflammatory cytokines, TNF and IL-1β. Activation of A1R was able to prevent the increase in cell death caused by exposure to elevated glucose. Blockade of A2AR and ENT1 transport was also very effective in preventing cell death under the same experimental conditions. As for the studies indiabetic rats, treatment with the A2AR antagonist for seven days exerted a potential beneficial effect on retinal dysfunction caused by diabetes, with improvements detected in scotopic b-wave amplitude and latency of oscillatory potentials. A2AR blockade was also beneficial against neuronal cell death, improving retinal ganglion cell survival in diabetic rats. In conclusion, this work shows that in retinal cells exposed to hyperglycemic conditions and in the diabetic retina, the adenosinergic system undergoes alterations in the majority of its components. Furthermore, we have shown that modulation of adenosine signaling can improve retinal cell survival in both cell cultures exposed to elevated glucose and in diabetic retinas, preventing also some retinal electrophysiological abnormalities detected in diabetic retinas, suggesting that modulation of A2AR may constitute a potential new therapeutic strategy to treat diabetic retinopathy in its early stages.FCT - SFRH/BD/51195/201