Radioactive labeling of NP with albumin to study the biodistribution

Dissertação de mestrado em Biotecnologia Farmacêutica, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra.Diabetes mellitus is characterized by hyperglycemia and there are three main types: type I, type II and gestational. The prevalence of diabetes is increasing and all patients with type I diabetes, and about 35% of type II diabetics require insulin therapy. When insulin is administrated by subcutaneous injection, every tissue are exposed to the same concentration and only a fraction of the injected dose is delivered to the liver. NP (NP) have been considered for oral insulin delivery by stabilizing and ensuring its biological activity in vivo and by facilitating intestinal delivery and absorption. Thus, the insulin delivered by the NP mimic the endogenous insulin. The aim of this work was study the biodistribution of the NP, therefore the biodistribution of 99mTc-BSA(bovine serum albumin) and 99mTc-BSA-NP was carried out after the BSA and BSA-NP radiolabeling and a quality control procedure was developed and optimized. NP were formulated by emulsification/internal gelation, which nucleus consists of alginate, dextran sulfate, calcium carbonate and insulin following complexation with chitosan and coated with BSA. To optimize radiolabelling procedure of BSA, different parameters were tested, namely, ligand and reducing agent concentration, pH, radionuclide activity, temperature and incubation time. To optimize the quality control of the radiolabeling procedure different mobile phases and stationary phases was tested. To evaluate radiopharmaceuticals biodistribution, a comparative study between 99mTc-BSA and 99mTc-BSA-NP was developed. The complexes were administered by gavage in Balb/c mice. The animals were killed at different time intervals: 0, 30, 60, 90, 120, 180, 360 and 1440 minutes after administration. Gastrointestinal tract and several organs and fluids were collected. Furthermore, the gastrointestinal content was separated from the gastrointestinal wall, whose was cleaned. All biological material collected was weighed and its radioactivity was evaluated by image processing. The percent of administered activity per milligram of organ was calculated. Radiochemical purity was determined by two systems with strips of instant thin-layer chromatography-silica gel (ITLC-SG) as stationary phase and NaCl (sodium chlorate) and ACD (acid citrate-dextrose) as mobile phases. The radiochemical purity obtained was higher than 95% and remain stable at least for 6h. These results were obtained by using: sodium thiosulfate 10mg.ml-1; HCl (hydrochloric acid), N; BSA 10mg.ml-1; phosphate buffer (pH 7.4) (1.0/1.0/2.5/2.0) (v/v/v/v) and 1110 to 2220 MBq of Na99mTcO4- (sodium perthecnetate). The biodistribution studies revealed that 99mTc-BSA-NP have different profiles of adhesion to the stomach and small intestine epithelium regardless of the profile of the contents’ progression XVIII in the gut, comparatively to the 99mTc-BSA biodistribution. Six hours after administration most of the complex was in the large intestine and all the activity was eliminated 24h after administration. The labelling procedure of BSA was stable, reproducible and reveals potential to track albumin. Differences between 99mTc-BSA-NP and 99mTc-BSA seem to do due to the mucoadhesive properties of the NP’ polymers, namely chitosan. However, to evaluate insulin absorption future studies should be carried out.A diabetes mellitus é caracterizada por hiperglicemia e a doença manifesta-se em diferentes tipos, sendo os principais, o tipo 1, o tipo 2 e a gestacional. A prevalência da diabetes tem aumentado e todos os doentes com diabetes tipo I e cerca de 35% dos diabéticos tipo 2 têm de recorrer à terapia com insulina. A insulina administrada pela via subcutânea leva a uma exposição de todos os tecidos à mesma concentração da insulina e apenas uma fracção da dose injectada é captada pelo fígado. As nanopartículas (NP) para administração oral da insulina têm vindo a ser consideradas por assegurarem e estabilizarem a sua actividade biológica in vivo, mas também por facilitarem a sua entrega e absorção em meio intestinal. Desta forma, a insulina administrada com recurso às nanopartículas mimetizaria a insulina endógena. O objectivo deste trabalho era estudar a biodistribuição das nanoparticulas, para tal procedeu-se ao estudo da biodistribuição do 99mTc-BSA(bovine serum albumin) e do 99mTc-BSA-NP, após o desenvolvimento e optimização do controlo de qualidade e da marcação radioactiva do BSA e do BSA-NP. As nanopartículas foram produzidas por emulsificação/gelação interna, o seu núcleo é constituído por alginato, sulfato de dextran, carbonato de cálcio e insulina, sofre complexação com o quitosano e é revestido por BSA. Relativamente à optimização do controlo de qualidade do procedimento de radiomarcação foram testadas diferentes fases móveis e fases estacionárias. Para optimizar a radiomarcação do BSA foram testados diferentes parâmetros, nomeadamente, a concentração de ligando e agente redutor, pH, a actividade do radionuclídeo, temperatura e tempo de incubação. Para avaliar a biodistribuição dos radiofármacos foi realizado um estudo comparativo entre o 99mTc-BSA e o 99mTc-BSA-NP. Ambos os complexos foram administrados por gavagem a ratinhos Balb/c. Os animais foram sacrificados a diferentes intervalos de tempo: 0, 30, 60, 90, 120, 180, 360 e 1440 minutos após a administração. O tracto gastrointestinal e vários órgãos e fluidos foram recolhidos, para além disso, o conteúdo gastrointestinal foi separado da parede gastrointestinal, que por sua vez foi lavada. Todo o material biológico recolhido foi pesado e a radioactividade foi avaliada pelo processamento das imagens e foi calculada a percentagem de actividade administrada por miligrama. A pureza radioquímica foi determinada com recurso a dois sistemas cromatográficos, cuja fase estacionária eram tiras de cromatografia em camada fina instantânea-gel de sílica (do inglês, ITLC-SG) e a fase móvel era NaCl (cloreto de sódio) e ACD (ácido de citrato-dextrose). A pureza radioquímica obtida foi superior a 95% e mantem-se estável por 6h. XX Estes resultados foram obtidos com 10mg.ml-1 de tiossulfato de sódio; HCl (ácido clorídrico), N; 10mg.ml-1 de BSA; tampão fosfato a pH 7.4, (1.0/1.0/2.5/2.0) (v/v/v/v) e 1110 to 2220 MBq de Na99mTcO4- (pertecnetato de sódio). Os estudos de biodistribuição revelaram que o 99mTc-BSA-NP tem um perfil diferente de adesão à parede do estomago e do intestino delgado, independente do perfil de progressão do conteúdo ao longo do tracto gastrointestinal, quando comparado com a biodistribuição do 99mTc-BSA. Seis horas após a administração dos radiofármacos estes encontram-se maioritariamente no intestino grosso e 24h após a administração toda a actividade já foi eliminada. O procedimento de marcação do BSA é estável e reprodutível e revela potencial para acompanhar o BSA. As diferenças entre o 99mTc-BSA-NP e o 99mTc-BSA parecem ser devidas às propriedades mucoadesivas dos polímeros que constituem as nanoparticulas, mais concretamente o quitosano. Contudo, para avaliar a absorção da insulina devem ser efectuados outros estudos