Targeted intracellular delivery of synergistic drug combinations: tackling drug resistance in human breast cancer

Tese de doutoramento em Ciências Farmacêuticas, no ramo de Tecnologia Farmacêutica, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de CoimbraBreast cancer remains a major public health care burden, with tremendous impact on society. Therapeutic intervention is often undermined by the intrinsic heterotypic nature of tumors, in which a multitude of cell types intertwine to foster new biological features that support tumor development. Among them, resistance to cornerstone chemotherapies remains pivotal. It has been postulated that cancer stem cells (CSC), a sub-population of stem-like cancer cells exhibiting self-renewal capability and high tumorigenic capacity, have a central role in tumor development, metastization, recurrence as well as drug resistance. In addition, the recent acknowledgement that CSC can originate from non-stem cancer cells (non-SCC) highlighted the need to develop strategies targeting both cell sub-populations. It has been recognized that success requires the identification of compounds that, when combined, lead to synergistic tumor inhibition. However, in vivo application of such protocols is dependent on the ability to deliver the appropriate drug ratio at the tumor level. In this respect, nanotechnology-based delivery platforms, like liposomes, offer an elegant solution for the in vivo translation of such strategy. Modifying drugs’ pharmacokinetics by the co-encapsulation into liposomes enables one to achieve the synchronous temporal and spatial delivery of a drug combination at tumor site. Additionally, the coating of nanoparticles with ligands targeting specific overexpressed receptors would enable the precise delivery of drug combinations into particular cellular sub-populations, such as the CSC, ultimately enabling a gain in terms of efficacy while simultaneously decreasing systemic toxicity. In the present work, it is described the development of a PEGylated liposomal formulation co-encapsulating a combination of doxorubicin (inner aqueous core) and the pro-apoptotic C6-ceramide (liposomal membrane bilayer), capable to target, by a ligand coupled at its surface, both putative breast CSC and non-SCC, besides other tumor cells. The ligand - F3 peptide - enables the specific binding to nucleolin (NCL), a protein overexpressed by cancer cells and endothelial cells of tumor angiogenic blood vessels, promoting active nanoparticle internalization. In addition, a pH-sensitive triggered release mechanism enabling burst release of the cargo upon intracellular delivery, upon endosomal acidification, has also been included. Drug screening has demonstrated that a combination of doxorubicin (DXR):C6-ceramide (C6-Cer) at 1:2 molar ratio interacted synergistically against drug resistant/triple negative MDA-MB-231 breast cancer cells, as well as drug sensitive MDA-MB-435S melanoma cells. F3 peptide-targeted liposomes encapsulating the DXR:C6-Cer 1:2 molar ratio performed similarly as targeted liposomal DXR, encapsulating twice the amount of DXR. Importantly, F3-targeted liposomes encapsulating DXR:C6-Cer 1:2 molar ratio enabled a cell death above 90% at 24 h of incubation against both DXR-resistant and sensitive cells, unattainable by the F3 peptide-targeted liposomal doxorubicin. Furthermore, a F3-targeted formulation encapsulating a mildly additive/antagonistic DXR:C6-Cer 1:1 molar ratio enabled an effect above 90% for an incubation period as short as 4 h, suggesting that delivery route, at the cell level, may shift the nature of drug interaction. Such activity induced a marked cell and nucleus swelling at similar extent, consistent with necrotic cell death. Moreover, it was demonstrated that F3 peptide-targeted liposomes associated with both breast non-SCC and putative CSC, but in higher extent with the latter (2.6- and 3.2-fold for triple negative MDA-MB-231 and luminal-like MCF-7 cells, respectively), in an energy-dependent process. Increased mRNA levels of NANOG and OCT4 transcription factors, paralleled by NCL, were found in putative breast CSC as compared to non-SCC, from triple negative breast cancer cells. Additionally, using mouse embryonic stem cells as stemness bona fide model, it was shown that both NCL mRNA levels and cellular association of F3 peptide-targeted liposomes were dependent on stemness status. In addition, it was demonstrated that triple negative breast NCL+ cells were more tumorigenic than NCL- cells, paralleling putative breast CSC behavior. Furthermore, F3 peptide-targeted triggered-release liposomes promoted the efficient and simultaneous delivery of DXR:C6-Cer combinations into triple negative breast CSCs, enabling extensive cell death. Altogether, the results presented in chapters 2 and 3 of this thesis demonstrated that F3 peptide-targeted intracellular delivery of different DXR:C6-Cer ratios, with diverse drug interactions, enabled a significant increase of efficacy against chemotherapy resistant cells. Additionally, the results suggested a clear link between NCL expression (including cell membrane NCL) and the stem cell-like phenotype, namely in triple negative breast cancer, enabling the simultaneous intracellular delivery of drug combinations-containing liposomes functionalized with the F3 peptide into both CSC and non-SCC. Provided the necessary accessibility to the CSC niche, this technology, combined with the established NCL-mediated targeting of tumor angiogenic blood vessels, has the potential to simultaneously debulk multiple cellular compartments of the tumor microenvironment, while decreasing tumor recurrence and systemic toxicity, ultimately providing long-term disease free survival.O cancro da mama representa um enorme problema de saúde pública com grande impacto na sociedade. A abordagem terapêutica é muitas vezes comprometida pela natureza heterotípica intrínseca dos tumores nos quais diferentes tipos celulares interagem conduzindo o ganho de novas funções biológicas que suportam o desenvolvimento do tumor. Entre outras, a resistência a quimioterapia permanece uma questão central. As células estaminais cancerígenas (CSC) representam uma subpopulação celular com características estaminais com elevada capacidade de renovação e elevado potencial tumorigénico. Estas têm um papel fundamental no desenvolvimento tumoral, metastatização, recorrência, assim como na resistência a fármacos. O facto reconhecido recentemente de que as células cancerígenas não-estaminais (non-SCC) podem dar origem a CSC sublinha a necessidade de se encontrarem estratégias terapêuticas direcionadas simultaneamente a estas subpopulações. O sucesso de uma intervenção terapêutica eficaz poderá estar dependente da identificação de combinações de fármacos capazes de inibir sinergicamente o crescimento tumoral. No entanto, a aplicação de protocolos desta natureza in vivo é dependente da entrega, ao nível do tumor, do rácio de fármacos adequado. Nesse sentido, plataformas nanotecnológicas de entrega de fármacos, como os lipossomas, representam uma abordagem adequada para a translação in vivo daquela estratégia. A alteração da farmacocinética, através da co-encapsulação em lipossomas, permite a entrega da combinação de fármacos de forma sincronizada, espacial e temporalmente, ao nível do tumor. A funcionalização destas nanopartículas com ligandos direcionados a recetores específicos poderia permitir a entrega de uma combinação de fármacos a subpopulações celulares particulares, como as CSC, levando a um aumento da eficácia e, simultaneamente, a uma diminuição de toxicidade sistémica. No âmbito do presente trabalho, é descrito o desenvolvimento de lipossomas PEGuilados, encapsulando uma combinação de doxorrubicina (núcleo aquoso) e C6-ceramida (bicamada lipídica) direcionados, através de um ligando à superfície, às CSC e non-SCC da mama, para além de outras células tumorais. O ligando – peptídeo F3 – reconhece especificamente a nucleolina (NCL), uma proteína abundante em células cancerígenas e células endoteliais de vasos angiogénicos de tumores, levando à internalização ativa da nanopartícula. Foi ainda incluindo um mecanismo de libertação de fármacos sensível ao pH, ativado após internalização seguida de acidificação dos endossomas. Após screening, demonstrou-se que a combinação doxorrubicina (DXR):C6-ceramide (C6-Cer) no rácio molar de 1:2 interagiu sinergicamente contra células cancerígenas da mama MDA-MB-231 (resistentes/triplas negativas), assim como em células de melanoma (MDA-MB-435S) sensíveis a fármacos. Os lipossomas direcionados pelo peptídeo F3, co-encapsulando o rácio molar 1:2 da combinação DXR:C6-Cer foram semelhantes, em termos de eficácia, à DXR lipossomal direcionada pelo mesmo peptídeo e encapsulando o dobro da quantidade desta. Não menos importante, os lipossomas direcionados pelo peptídeo F3 contendo a combinação DXR:C6-Cer 1:2 levaram a uma morte celular acima de 90% após 24 h de incubação em ambas a linhas, o que não se verificou para a lipossomas direcionados contendo apenas DXR. Por outro lado, lipossomas direcionados pelo peptídeo F3, encapsulando a combinação DXR:C6-Cer no ratio molar 1:1 (aditivo/antagonista) conduziram a uma morte celular superior a 90% para um período de incubação de 4 h, sugerindo que a natureza da interação entre fármacos pode mudar com a via de entrada na célula. Tal atividade levou a um aumento do tamanho celular e nuclear, consistente com morte celular por necrose. Adicionalmente foi demonstrado que os lipossomas direcionados pelo peptídeo F3 associavam ativamente com ambas non-SCC e CSC da mama, em maior extensão com estas últimas (2,6 e 3,6 vezes para as linhas MDA-MB-231 e MCF-7 (tipo luminal), respetivamente). Também foram encontrados níveis de mRNA dos fatores de transcrição NANOG e OCT4 aumentados, à semelhança da NCL, nas CSC triplas negativas quando comparadas com non-SCC. Usando células estaminais embrionárias de murganho como modelo bona fide de propriedades estaminais, foi demonstrado que o nível de mRNA da NCL assim como a associação celular de lipossomas direcionados pelo peptídeo F3 era dependente do estado estaminal. Demonstrou-se ainda que células cancerígenas da mama NCL+, triplas negativas, eram mais tumorigénicas do que células NCL-, um comportamento semelhante às CSC. Em paralelo, mostrou-se que os lipossomas direcionados pelo peptídeo F3 promoveram uma entrega eficiente da combinação DXR:C6-Cer em CSC da mama triplas negativas, levando a uma extensa morte celular. Em suma, os resultados apresentados nos capítulos 2 e 3 desta tese demonstraram que a entrega intracelular, direcionada pelo peptídeo F3, de diferentes ratios DXR:C6-Cer conduziu a um aumento relevante da eficácia contra células resistentes à quimioterapia. Ainda, os dados sugeriram uma ligação clara entre a expressão de NCL e o fenótipo estaminal, nomeadamente em cancro da mama triplo negativo, permitindo a entrega intracelular de lipossomas direcionados pelo peptídeo F3 encapsulando combinações de fármacos, a ambas CSC e non-SCC. Assegurada a acessibilidade ao nicho das CSC, esta tecnologia, aliada ao direcionamento para os vasos angiogénicos dos tumores mediado pela NCL já descrito, tem o potencial de atacar múltiplos compartimentos celulares do microambiente tumoral, levando a uma diminuição da recorrência e da toxicidade, potencialmente providenciando um aumento da esperança de sobrevivência a longo termo de doentes com tumores de mama.FCT - SFRH/BD/64243/200