Brain dysfunction and cell death in type 2 diabetes : A neuroprotective role for the peripheral treatment with Exendin-4

Dissertação de mestrado em Bioquímica, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de CoimbraA Diabetes tipo 2 e a doença de Alzheimer são, nos dias de hoje, dois graves problemas de saúde pública. A diabetes tipo 2 afecta milhões de pessoas em todo o mundo e os seus números continuam a aumentar. Esta epidemia tem grandes repercussões no quotidiano dos pacientes, maioritariamente devido às suas complicações crónicas que podem afectar não apenas vários órgãos periféricos, mas também o cérebro, constituindo inclusivamente um factor de risco para o desenvolvimento da doença de Alzheimer. Esta é a forma de demência mais comum, na qual a resistência à insulina (uma das características da diabetes tipo 2) tem sido amplamente descrita, pelo que tem sido colocada a hipótese de que a doença de Alzheimer e a Diabetes tipo 2 serão mais do que meras patologias não interrelacionadas. De facto, um número crescente de evidências científicas sugere a existência de inúmeros elos moleculares de ligação entre as duas patologias (ex.: dismetabolismo da glucose, insulina e disfunção mitocondrial, stresse oxidativo), que poderão culminar em morte celular e consequente disfunção cerebral. Assim, a doença de Alzheimer tem sido cada vez mais referida como uma “diabetes tipo 3” ou uma “diabetes tipo 2 específica do cérebro”. Nesta perspectiva, tem sido recentemente sugerido que fármacos eficientes contra a diabetes tipo 2 poderão também constituir uma estratégia terapêutica contra a demência (particularmente contra a doença de Alzheimer). Um dos fármacos anti-diabéticos potencialmente promissores é a exendina-4, pertencente à classe das incretinas/agonistas dos receptores do GLP-1 (correspondente a glucagon-like peptide-1) e já utilizado clinicamente no tratamento da diabetes tipo 2. Além do seu efeito insulinotrópico a nível periférico, por se tratar de um fármaco sintético do tipo das incretinas, a exendina-4 possui a capacidade de induzir o chamado “efeito incretina” (promove a secreção de insulina dependente de glucose), sendo resistente à degradação por parte da enzima dipeptidil peptidase-IV e diminuíndo o risco de hipoglicemia frequentemente associado aos fármacos anti-diabéticos “tradicionais”. Adicionalmente, tem sido descrito que a exendina-4 reduz a ingestão de alimentos e, desta forma, poderá constituir uma terapia anoréctica eficaz. Mais relevante para este estudo parece ser o número crescente de evidências de que a exendina-4 poderá desempenhar também um papel neuroprotector, estando inclusivamente a decorrer vários ensaios clínicos neste sentido. Contudo, os mecanismos moleculares precisos subjacentes à neuroprotecção pela exendina-4 contra a disfunção cognitiva associada a diabetes tipo 2 e doença de Alzheimer continuam por esclarecer. Desta forma, no presente estudo colocámos a hipótese de que a exendina-4 melhora as alterações periféricas associadas à diabetes tipo 2, bem como dos mecanismos intracelulares de controlo de qualidade no cérebro, neurodegeneração e morte celular, melhorando assim a função sináptica e, em última análise, a função cognitiva em condições de diabetes tipo 2. Assim, tivemos como objectivo principal analisar o potencial efeito neuroprotector da administração contínua, crónica e periférica com exendina-4, utilizando para este efeito o cérebro de ratos meia-idade, diabéticos tipo 2. Mais especificamente, avaliámos o papel da administração crónica periférica de exendina-4 em ratos diabéticos tipo 2, ao nível dos seguintes parâmetros periféricos: 1) características patológicas (níveis sanguíneos de glucose, taxa de remoção de glucose do sangue, níveis de insulina e hemoglobina glicosilada no plasma e resistência à insulina); 2) outros factores de risco associados à diabetes tipo 2 (como o peso corporal, hipercolesterolémia e elevada pressão sanguínea), assim como em amostras de córtex cerebral: 3) marcadores de stresse oxidativo, 4) (dis)função sináptica, 5) mecanismos de controlo de qualidade celular (autofagia) e 6) neurodegeneração e morte celular necrótica e apoptótica (dependente e independente de caspases). No presente estudo foram utilizados homogeneizados de córtex cerebral de ratos não-diabéticos Wistar e iv diabéticos tipo 2 não-obesos Goto-Kakizaki, ambas as estirpes correspondiam a ratos de 8 meses, submetidos continuamente (ou não) à administração periférica de exendina-4 (5 g/kg/dia, velocidade de infusão de 2.5 l/h), durante 28 dias, mediante implantação subcutânea de bombas micro-osmóticas Alzet. Os animais foram monitorizados antes e periodicamente durante o tratamento, no sentido de avaliar o seu bem-estar dos animais e o sucesso do tratamento. No final deste, os ratos foram eutanasiados e os parâmetros sanguíneos relacionados com a diabetes tipo 2 e os seus factores de risco mais comuns foram determinados. Adicionalmente, foram preparados homogeneizados citosólicos corticais e respectivas fracções mitocondriais isoladas, de modo a serem utilizados na quantificação dos níveis de GLP-1, insulina e glucose, bem como nos níveis de expressão proteica do receptor do GLP-1 e na activação do receptor de insulina, mediante aplicação das técnicas de ELISA, “western blotting” ou co-imunoprecipitação. Seguidamente, procedeu-se à determinação, por colorimetria, ELISA ou “immunoblotting”, de vários marcadores de oxidação de lípidos e ADN, autofágicos, de apoptose dependente e independente de caspases e de necrose. Finalmente, o papel de exendina-4 na função sináptica do córtex de cérebros de ratos diabéticos tipo 2 foi também avaliado por “western blotting”. No presente estudo, observámos que a administração contínua periférica de exendina-4 pareceu suplantar as características patológicas periféricas associadas à diabetes tipo 2 (hiperglicemia, menor taxa de remoção de glucose do sangue, níveis elevados de hemoglobina glicosilada e resistência à insulina). Além disso, a exendina-4 recuperou os níveis de GLP-1 no córtex cerebral de ratos GK e, apesar de não ter mostrado efeitos significativos na expressão proteica do receptor do GLP-1, não descartamos a hipótese de que o fármaco melhore a actividade deste receptor no cérebro. Todavia, a clarificação deste assunto requer estudos adicionais. Surpreendentemente, a exendina-4 não afectou os níveis corticais de insulina nem a activação do seu receptor, sugerindo que este poderia não estar directamente envolvido nos efeitos subsequentes da exendina-4 no cérebro de ratos GK. Tais efeitos incluíram o restabelecimento dos níveis de glucose no cérebro e uma tendência para a exendina-4 proteger contra a oxidação lipídica e do ADN. Notavelmente, os nossos resultados também apontaram para uma activação tendencialmente maior do processo autofágico no córtex cerebral dos ratos GK tratados com exendina-4, provavelmente constituindo uma estratégia protectora contra a morte celular mediada pela caspase-3 associada à diabetes tipo 2 nos ratos GK tratados com solução placebo. De acordo com esta sugestão, a exendina-4 pareceu inibir a apoptose induzida pela caspase 3 no córtex cerebral dos ratos GK diabéticos tipo 2, provavelmente devido à (pelo menos parcialmente) sua tendência para reter a proteína antiapoptótica Bcl2 e a pro-apoptótico citocromo c na mitocôndria, enquanto a Bax (outra proteína pro-apoptótica) permaneceu no citosol, originando posteriormente uma ligeira melhoria na função cortical dos ratos diabéticos tipo 2 expostos a exendina-4. Em suma, os nossos resultados sugerem que, através de uma melhoria das características patológicas periféricas da diabetes tipo 2, a terapia crónica com exendina-4 por via subcutânea poderá ter um impacto benéfico no córtex cerebral de ratos machos, não obesos e diabéticos tipo 2 de meia-idade, através do restabelecimento dos níveis de GLP-1 e protegendo contra eventuais danos associados a hiperglicemia local e stresse oxidativo. Essa protecção pela exendina-4 provavelmente envolverá uma estimulação “fisiológica” dos mecanismos de autofagia, com o consequente impedimento da morte celular apoptótica e da disfunção sináptica. Nesta perspectiva, a administração crónica periférica de exendina-4 poderá constituir uma abordagem terapêutica promissora contra as complicações a longo-termo da diabetes tipo 2, nomeadamente as que afectam directamente o cérebro.Type 2 diabetes (T2D) and Alzheimer disease (AD) are two major health care issues nowadays. T2D affects millions of people worldwide, whose number continues to increase. This epidemic has major repercussions in the patients’ daily life, mainly due to its chronic complications that can affect not only several peripheral organs, but also the brain, and constitutes a risk factor for development of AD. AD is the most common form of dementia, in which insulin resistance (one of main hallmarks of T2D) has been widely described, thus rendering both AD and T2D more than mere unrelated pathologies. Indeed, increasing evidences suggest that T2D and AD share several common molecular links (e.g. glucose dysmetabolism, insulin and mitochondrial dysfunction, oxidative stress) that culminate in brain dysfunction and cell death. As such, AD has been increasingly referred to as “type 3 diabetes” or a “brain-specific T2D”. In line with this, it has been recently hypothesized that efficient drugs against T2D could be also a beneficial therapeutic strategy against dementia (particularly AD). And one of such potentially promising anti-T2D drugs is exendin-4 (Ex-4), a already clinically used compound from the incretin/glucagon-like peptide-1 (GLP-1) receptor (GLP-1R) agonists class of anti-T2D drugs. Besides its peripheral insulinotropic effect, as a synthetic incretin-like compound, Ex-4 is known to have an incretin effect (promoting a glucose-dependent insulin secretion), being resistant to dipeptidylpeptidase-IV (DPP-IV) degradation and lowering the risk of hypoglycemia, often associated to the “traditional” anti-T2D therapies. Importantly, Ex-4 has been also described as a potential food intake reducer, an anorectic drug and, most importantly herein, a highly promising neuroprotective agent, with clinical trials already ongoing in this line. However, the knowledge on the precise molecular mechanisms underlying such neuroprotection against chronic T2D-associated cognititve dysfunction and AD remain unclear. Under this perspective, we hypothesized that Ex-4 restores the T2D-associated alterations in intracellular quality control mechanisms, neurodegeneration and death, thereby improving synaptic function and, ultimately, cognitive function. Therefore, our main goal was to study the potential neuroprotective effect of chronic, continuous peripheral Ex-4 treatment in middle-aged T2D rat brain. More specifically, we evaluated the role of chronic peripheral Ex-4 administration in T2D: 1) pathological features (blood glucose levels, rate of glucose clearance from blood, plasma insulin and glycosylated hemoglobin A1C (HbA1C) levels and insulin resistance); 2) other T2D-associated risk factors (as body weight, hypercholesterolemia, hypertriglyceridemia and high blood pressure), as well as in 3) rat brain cortical markers of oxidative stress, 4) synaptic (dys)function, 5) cellular quality control (autophagic) mechanisms and 6) neurodegeneration, caspase-dependent and – independent apoptotic and necrotic cellular death. Herewith, we used middle-aged (8 month old) non-diabetic male Wistar and non-obese, T2D Goto- Kakizaki (GK) rat brain cortical homogenates, either submitted or not to the continuous peripheral delivery of Ex-4 (5 g/kg/day, at an infusion rate of 2.5 l/h), for 28 days, upon subcutaneous implantation of microosmotic Alzet pumps. Animals were monitored before and periodically during treatment to determine animals’ welfare and treatment’s success. At the end of treatment, rats were euthanized and peripheral blood parameters related with T2D and its commonly associated risk factors were determined. Additionally, brain cortical cytosolic homogenates and isolated mitochondrial fractions were obtained to be used in the quantification of GLP-1, insulin and glucose levels, GLP-1R protein expression levels and insulin receptor (IR) activation, by ELISA, western blotting or co-immunoprecipitation. This was followed by the colorimetric, ELISA or immunoblotting determination of several lipid and DNA oxidation, autophagic and caspase-dependent and – vii independent apoptosis markers, as well as of necrotic markers. Finally, the role of Ex-4 on T2D-related brain cortical synaptic function was also evaluated by western blotting. We observed that the continuous peripheral administration of Ex-4 was able to overcome the peripheral T2D pathological hallmarks (hyperglycemia, rate of glucose clearance from blood, HbA1C levels and insulin resistance). Moreover, Ex-4 restored brain cortical GLP-1 levels in GK rats and, despite no significant effects on GLP-1R protein expression, it is possible that the drug may improve its activity in brain. However, this deserves further analysis. Surprisingly, Ex-4 did not interfere with brain cortical insulin levels or its receptor activation, suggesting that these may not be directly involved in the subsequent effects of Ex-4 in GK rat brain. Such effects include a restoration of brain glucose levels and a tendency for Ex-4 to protect against lipid and DNA oxidation. Notably, our results also pointed towards a tendentially higher activation of the autophagic process in brain cortices from the Ex-4-treated GK rats, probably as a protective strategy against the subsequently reported T2D-related caspase-3-mediated death in placebo-treated GK rats. Indeed, Ex-4 appeared to inhibit the caspase-3-induced apoptosis in T2D GK rat brain cortices, probably due (at least partially) to its tendency to retain the anti-apoptotic Bcl2 and the proapoptotic cytochrome c within mitochondria, whereas the proapoptotic Bax remained in the cytosol, ultimately leading to a slightly improved brain cortical function in Ex-4-exposed T2D rats. Altogether, our results suggest that by ameliorating the peripheral T2D pathological hallmarks, chronic continuous subcutaneous Ex-4 has a beneficial impact in middle-aged non-obese T2D male rat brain cortex, restoring GLP-1 levels and protecting against local hyperglycemia- and oxidative stress-mediated injury, probably via the stimulation of a physiological-like autophagy and the subsequent hampering of apoptotic death and synaptic dysfunction. In sum, chronic peripheral Ex-4 administration may constitute a potential therapeutic approach against long-term complications of T2D per se affecting the brain