MicroRNA modulation in combination with chemotherapeutic drugs as a novel therapeutic strategy for pancreatic cancer

Tese de doutoramento em Bioquímica, na especialidade de Tecnologia Bioquímica, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciência e Tecnologia da Universidade de CoimbraO adenocarcinoma ductal do pâncreas (ACP) é uma neoplasia altamente agressiva, com um carácter acentuadamente invasivo e um perfil de expressão de microRNAs anormal, que tem sido fortemente associado à malignidade do ACP. A gemcitabina é o fármaco mais utilizado na terapia deste tipo de cancro, embora sem grande impacto na sobrevivência dos pacientes. A falta de tratamentos eficazes para o ACP levou-nos a considerar a possibilidade de usar os microRNAs, como potenciais alvos terapêuticos, no desenvolvimento de uma estratégia de terapia génica com relevância clinica para esta doença. Os microRNAs são uma empolgante e promissora classe de pequenas moléculas de RNA capazes de regular pós-transcricionalmente a expressão génica. Cada tipo de cancro é caracterizado por uma assinatura genética de microRNAs, apresentando uma forte desregulação nos níveis de expressão dos mesmos. Desde modo, acreditamos que reequilibrar os níveis de microRNAs em células tumorais pode ser decisivo no tratamento do cancro em geral e do ACP em particular. Assim, desenhámos uma estratégia terapêutica para abordar o cancro do pâncreas, que consistiu na combinação da modulação dos níveis de expressão de microRNAs, utilizando sistemas de transporte e entrega de material genético, com pequenas doses de fármacos, de forma a promover um forte efeito antitumoral e reduzir possíveis efeitos secundários. A primeira parte deste trabalho foi focada no estudo do potencial de um nanosistema, composto por albumina–1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina: colesterol/oligonucleótidos anti-microRNAs (OAMs), na razão de carga (+/-) (4/1), para efectuar de forma eficiente a entrega de oligonucleótidos contra microRNAs, como o miR-21, miR-221, miR-222 e miR-10, que se encontram sobrexpressos em células tumorais de ACP. O nanosistema desenvolvido promoveu uma internalização celular eficiente do seu conteúdo, tendo induzido uma redução significativa nos níveis de expressão de todos os microRNAs testados e um aumento significativo dos alvos diretos do miR-21 e do grupo miR-221/miR-222, os supressores tumorais PTEN e p27kip1, respectivamente. Adicionalmente, avaliou-se o potencial terapêutico da combinação dos OAMs com pequenas quantidades de fármacos. Para tal, procedeu-se à transfeção das células de ACP com o nanosistema contendo AMOs e posteriormente ao tratamento com fármacos. Os resultados obtidos mostraram que o silenciamento do miR-21 e miR-221 sensibiliza as células tumorais à acção do sunitinib e que a sua acção conjunta promove um efeito sinergístico antitumoral substancial. Estes factos demonstram o grande potencial do nanosistema gerado para mediar a entrega de OAMs e da estratégia antitumoral combinada. A segunda parte do trabalho centrou-se no desenvolvimento de uma nova estratégia terapêutica a visando a supressão da metastização, e no esclarecimento dos mecanismos biológicos envolvidos. O microRNA-139-5p, previamente identificado encontrar-se silenciado em ACP, foi indicado como potencial regulador da expressão do receptor 4 da quimiocina C-X-C (CXCR4), tendo-se verificado constituir um marcador de células estaminais tumorais e desempenhar um papel crucial no processo de migração das células tumorais. Os nossos resultados mostraram que existe uma correlação inversa entre os níveis de miR-139-5p e a expressão do CXCR4 em várias linhas celulares de ACP. Após a transdução das células de ACP com um vector lentiviral contendo o gene que codifica o miR-139-5p, foi possível obter um aumento substancial dos níveis deste microRNA nestas células tumorais. Observou-se uma redução significativa quer dos níveis totais da proteína CXCR4, quer dos seus níveis na superfície celular. Adicionalmente, verificou-se um efeito inibitório em células com perfil invasivo, nomeadamente ao nível das suas características morfológicas. Os resultados obtidos mostraram também que o miR-139-5p altera o mecanismo indutor de migração, de forma dependente e não dependente do CXCR4, e diminui a capacidade clonogénica das células tumorais pancreáticas. Por fim, verificou-se que o miR-139-5p promove um efeito sensibilizador à acção de pequenas quantidades dos fármacos docetaxel ou sunitinib, tendo a combinação destas estratégias promovido um efeito sinergístico antitumoral significativo. Em conclusão, os nossos resultados indicam claramente que a modulação da expressão de microRNAs em células tumorais de cancro do pâncreas pode promover alterações fisiológicas relevantes para a supressão da sua tumorigenicidade e conduzir a uma maior susceptibilidade à acção antitumoral de fármacos, mesmo em doses reduzidas, resultando num efeito antitumoral sinergístico. Assim, uma estratégia antitumoral combinando a modulação de microRNAs com pequenas quantidades de agentes quimioterapêuticos apresenta-se promissora no tratamento do cancro pancreático.Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is a highly aggressive cancer, characterized by strong invasive features and aberrant microRNA expression which has been associated with hallmark malignancy of PDAC. Gemcitabine is the current standard treatment for PDAC, although no significant improvement in patient’s survival has been achieved. The lack of effective PDAC treatment options prompted us to investigate whether microRNAs would constitute promising therapeutic targets toward the generation of a gene therapy approach with clinical significance for this disease. MicroRNAs are an exciting new class of small RNA molecules that post-transcriptionally regulate gene expression. Each type of cancer, including PDAC, presents a microRNA signature, characterized by abnormal microRNA expression levels. Therefore, restoring appropriate microRNA levels in tumoral cells may be a crucial turn in PDAC treatments. Taking advantage of gene delivery vector technologies such as cationic liposomes (non-viral vectors) or viral–based vectors, we designed a therapeutic approach to manage pancreatic cancer, consisting of microRNA modulation in combination with small amounts of chemotherapeutic drugs, in order to promote a broader antitumoral effect and reduce potential side-effects. The first part of the work was focused on the potential of the human serum albumin–1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine:cholesterol/anti-microRNAoligonucleotides (AMOs) (+/-) (4/1) nanosystem to efficiently deliver AMOs, targeting the overexpressed microRNAs miR-21, miR-221, miR-222, and miR-10, into PDCA cells. The developed nanosystem promoted an efficient cellular internalization of the carried nucleic acids, and all tested microRNAs showed a significant reduction in their levels of expression. Moreover, our results clearly demonstrate that abrogation of miR-21 and miR-221/miR-222 cluster expression levels could induce a significant increase in their direct targets, the tumor suppressors PTEN and p27kip1, respectively. Additionally, experimental studies consisting of a two-step sequential treatment, where PDAC cells were firstly transfected with AMOS targeting miR-21, miR-221 and miR 222 and subsequently treated with chemotherapeutic drugs, allowed us to evaluate the impact of microRNA cell sensitization to chemotherapeutic drugs. The obtained results showed that the combination of microRNA silencing, namely miR-21, with low amounts of the chemotherapeutic drug sunitinib resulted in a strong and synergistic antitumor effect. Overall, these results are indicative of the great potential of the developed nanosystem, to efficiently mediate AMOs delivery, and of the generated combined strategy to mediate a significant and synergistic antitumor activity. The second part of the work was centered in the development of a new microRNA-based therapeutic strategy, focused on the suppression of the metastasis processes and in the clarification of the underlying biological mechanisms. MiR-139-5p was identified as a downregulated microRNA in PDAC and has been predicted to target C-X-C Chemokine receptor 4 (CXCR4). Emerging evidence suggests that CXCR4 exerts a crucial role in the metastatic process of PDAC, being enrolled in cell motility and proliferation, and was identified as a molecular marker in pancreatic cancer stem cells (PCSCs) with high metastatic potential. Our studies showed the existence of an inverse correlation between miR-139-5p and CXCR4 expression in this type of tumor. The use of a lentivirus-based vector able to stably express miR-139-5p in PDAC cells allowed the assessment of miR-139-5p relevance in the regulation mechanisms of CXCR4 In this regard, the ectopic expression of miR-139-5p in PDAC cells was shown to result in a substantial decrease of the CXCR4 protein levels, including the cellular surface CXCR4, and in a visible lack of classic motility features. Invasion assays indicated that miR-139-5p could affect CXCR4 dependent and non-dependent migration in cells overexpressing this microRNA. Furthermore, an inhibitory effect of miR-139-5p on the ability of PDAC cells to form spheres, particularly spheres with bigger dimensions, was observed, indicating a possible clonogenic suppressor role of miR-139-5p in this type of tumor. Importantly, modulation of miR-139-5p expression in PDAC cells was shown to enhance cell susceptibility to the action of small amounts of sunitinib or docetaxel, resulting in a significant and synergistic antitumor activity. Overall, our results clearly demonstrate that restoring expression levels of key microRNAs in pancreatic cancer constitutes a promising therapeutic strategy, particularly when combined with small doses of chemotherapeutic drugs, since it could result in a potent antitumor activity and reduced side effects.FCT - SFRH /BD /46903/200