Desenvolvimento de nanopartículas para o tratamento do cancro

Dissertação de mestrado em Biotecnologia Farmacêutica, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra.Cancer is one of the most emergent diseases in twenty-first century, mainly affecting developed countries. Therapies of preference for treatment of cancer have been chemotherapy, radiotherapy or surgery, these being associated with a reduced rate of survival and significant side effects. In addition, often chemotherapy and radiotherapy are not sufficiently effective in eliminating the tumor, mainly given to the development of resistance to chemotherapeutic agents and radiation. In order to overcome such issue, drug combination has been pursued as fundamental strategy to simultaneously inhibit multiple pathways that regulate the processes underlying resistance and tumor progression, ultimately leading to dose reduction and consequently minimizing severe side effects associated with chemotherapy. However, success is highly dependent on strategies that enable the delivery of a drug combination on site in a specific manner. Nanotechnology-based platforms for drug delivery, namely lipid-based nanoparticles, offer an interesting approach. These nanosystems enable proper control of drug pharmacokinetics and biodistribution, essential to guarantee that drugs reach tumor site simultaneously, while preventing extensive systemic toxicity. Therefore, in the present work we proposed two lipid-based PEGylated nanoparticles for the targeted delivery of drug combinations. Upon several modifications, a combination of a cytostatic with one of two bioactive lipids was encapsulated in the targeted nanoparticle. As a proof of principle, the properties of the developed nanosystems were measured, including size, loading efficiency, and drug retention in different conditions as a measure of stability. Additionally, delivery and cytotoxic potential were assessed using triple negative MDA-MB-231 breast cancer cell line and the MDA-MB-435S cell line. The results demonstrated that the developed formulations, containing the combination of cytostatic agent and either Lipid 1 or Lipid 2, share similar stability, however marginally lower than the formulation containing only the cytostatic. Importantly, the presence of bioactive lipids in liposome membrane did not impact the intracellular delivery as assessed by calcein-loaded liposomes. Additionally, it was demonstrated that the cytotoxic efficacy increased for combination-loaded liposomes when compared to liposomal cytostatic, a feature dependent on the incubation time, enabling a cell death above 90% in 24 h incubation period. Nonetheless, it was demonstrated that a liposomes co-encapsulating Lipid 1 and half of the amount of cytostatic performed similarly as controls encapsulating double the amount of the same agent. This is important as far as it could enable a reduction of dose of VII chemotherapeutic agent administered, thus leading reduction of systemic toxicity with minimal compromise in efficacy. In conclusion, the results here presented represent an important contribution for the development of targeted delivery of drug combinations employing lipid-based nanosystems. Additionally, they unravel the way for targeted delivery of bioactive lipids combined with small drug chemotherapeutics.O cancro é uma das doenças mais emergentes do século XXI, manifestando-se principalmente nos países desenvolvidos. As terapias de eleição para o tratamento do cancro têm sido a quimioterapia, a radioterapia ou a cirurgia, estando estas associadas a uma taxa reduzida de sobrevivência e a efeitos secundários significativos. Para além disso, é com frequência que a quimioterapia e a radioterapia, não são suficientemente eficazes na eliminação do tumor, muitas vezes devido ao desenvolvimento de resistência aos agentes quimioterapêuticos e à radioterapia. De forma a superar tal problema, a combinação de fármacos tem sido prosseguida como estratégia para inibir simultaneamente múltiplas vias que regulam processos subjacentes à resistência e à progressão do tumor, tendo como objetivo final a redução das doses empregadas, minimizando os efeitos secundários graves associados à quimioterapia. No entanto, o sucesso é muito dependente de estratégias que permitam a entrega da combinação de fármacos no local de uma forma específica. As plataformas nanotecnológicas para a entrega de fármacos, como é o caso dos lipossomas, oferecem uma abordagem interessante. Estes nanossistemas permitem o controlo adequado da farmacocinética e biodistribuição, essencial para garantir que os fármacos alcançam o local do tumor simultaneamente, prevenindo, ao mesmo tempo, uma elevada toxicidade sistémica. No presente trabalho, foram propostas duas nanopartículas PEGuiladas de base lipídica, para a entrega direcionada de combinações de fármacos. Após várias alterações, uma combinação de um cistostático com um dos lípidos bioativos, foi encapsulada em nanopartículas. Como prova de princípio, as propriedades dos nanosistemas desenvolvidos foram avaliadas, através da determinação do tamanho, eficiência de encapsulação, e retenção do fármaco em diferentes condições, como medida de estabilidade. Além disso, a entrega e o potencial citotóxico foram avaliados utilizando uma linha de cancro da mama triplo negativa, MDAMB- 231, e uma outra linha celular, as MDA-MB-435S. Os resultados demonstraram que as formulações desenvolvidas contendo a combinação do agente quimioterapêutico com o lípido 1 ou lípido 2, partilham uma estabilidade semelhante, embora ligeiramente mais baixa que a formulação contendo apenas o citostático. De salientar, a presença dos lípidos bioativos não interfere com a entrega intracelular, como foi avaliado através de lipossomas encapsulando calceína. Além disso, foi demonstrado que a eficácia citotóxica aumenta para os lipossomas contendo a combinação, comparativamente com o agente citostático lipossomal, uma característica dependente do tempo de incubação, IX permitindo uma morte celular acima dos 90% num período de 24h de incubação. No entanto, foi demonstrado que lipossomas com o lípido 1, co-encapsulando metade da quantidade de agente citostático, apresentam um efeito semelhante ao dos controlos encapsulando o dobro da dose do mesmo agente. Isto é importante na medida em que se pode reduzir a dose do agente quimioterapêutico administrado, conduzindo a uma redução da toxicidade sistémica, comprometendo minimamente a sua eficácia. Em conclusão, os resultados deste projeto representam uma importante contribuição para o desenvolvimento de combinações de fármacos direcionados utilizando nanosistemas à base de lípidos. Para além disso, estes desvendam o caminho para uma entrega direcionada de lípidos bioativos em combinação com fármacos quimioterapêuticos de baixo peso molecular