Selecção de ovócitos para as técnicas de reprodução assistida com base no estudo das células do Cumuolus

Dissertação de mestrado em Bioquímica, apresentada ao Departamento Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de CoimbraAs técnicas de reprodução assistida, criadas para ultrapassar o problema da infertilidade humana que afecta cerca de 13% a 15% dos casais em idade reprodutiva em todo o Mundo, encontram-se associadas a taxas de sucesso reduzidas (cerca de 30%). Um dos passos cruciais nestas técnicas é a escolha dos gâmetas a utilizar, assim como, dos embriões a transferir para o útero da mulher. Actualmente, a escolha dos melhores ovócitos recai em aspectos meramente morfológicos e, por isso, muito subjectivos. No ovário ao longo do desenvolvimento folicular, os ovócitos maturam e desenvolvem-se com uma estreita relação com as suas células circundantes, as células do cumulus. Estas células somáticas são essenciais no desenvolvimento do ovócito visto que auxiliam a maturação do ovócito, a sua condução no oviducto e participam nos mecanismos que controlam o acesso do espermatozóide ao ovócito. Dado que não se pode estudar e avaliar o ovócito a sua utilizar nas técnicas de reprodução assistida, pois iria destruir-se a célula, pretendeu-se avaliar diversos parâmetros nas células do cumulus e determinar se esses parâmetros se relacionam com o estado do ovócito, assim como, com parâmetros clinicamente relevantes. Assim neste trabalho, avaliaram-se parâmetros como a densidade das células do cumulus por ovócito, a expressão de receptores de progesterona (hormona que desempenha um papel importante na reprodução feminina), a expressão de conexina 43 (proteína integrante das junções gap, que são essenciais na comunicação entre as células do cumulus e o ovócito) e apoptose nas células do cumulus. Com este trabalho foi possível estabelecer que um ovócito humano é rodeado, em média, por 17216 ± 24227 células do cumulus. Além disso, a densidade das células do cumulus é dependente do grau de maturidade do ovócito, estando ovócitos em metafase II associados a mais células do cumulus do que os ovócitos em metafase I. Adicionalmente, descrevemos também que os ovócitos que dão origem a embriões de melhor qualidade são aqueles que são rodeados por células do cumulus num número mais elevado e com tendência a possuir menor incidência de apoptose. Os ovócitos maduros apresentaram células do cumulus com diferentes níveis de expressão de receptores de progesterona, sendo o receptor genómico nPR-A/B expresso em mais células do que o não genómico PGRMC1. O estabelecimento de gravidez parece estar relacionado com uma expressão mais alta de conexina 43 nas células do cumulus. No futuro, após a validação destes parâmetros com a análise de um maior número de amostras, espera-se poder seleccionar os ovócitos e/ou embriões a utilizar nas técnicas de reprodução assistida com base na avaliação das células do cumulus. Porém, ainda há muitos aspectos por estudar nestas células a fim de se estabelecer totalmente a relação das células do cumulus com o ovócito. Contudo, pode-se concluir que as células do cumulus apresentam um grande potencial como biomarcadores da qualidade do ovócito e do embrião. Idealmente, espera-se que o estudo e análise das células do cumulus levem a um aumento nas taxas de gravidez, aumentando o sucesso das técnicas de reprodução assistida.The assisted reproductive technologies, created to overcome the human infertility issue that affects about 13-15% of couples in reproductive age worldwide, are associated to low success rates (about 30%). One of the crucial steps on these techniques is the selection of the gametes, as well as, embryos for transfer to women uterus. Actually, the selection of the better oocytes resides only on morphological aspects and, consequently, it is very subjective. In the ovary, during the follicular development, oocytes maturate and develop with a strait relationship with their surrounding cells, the cumulus cells. These somatic cells are essential in the oocyte development because they facilitate the oocyte maturation, the oocyte conduction in the oviduct, as well as, the sperm access to the oocyte. As the study and evaluation of the oocyte that will be used for assisted reproductive technologies is not possible because we would destroy it, we pretend to evaluate several parameters in the cumulus cells and determine if those are related to the oocyte status, as well as, to relevant clinical parameters. In this work, we evaluate parameters like cumulus cells density per oocyte, expression of progesterone receptors (hormone that has an important role in female reproduction), expression of connexin 43 (gap junction protein, that is essential to cumulus cells and oocyte communication) and apoptosis in cumulus cells. With this work, we were able to establish that a human oocyte is surrounded by, on average, 17216 ± 24227 cumulus cells. Furthermore, the density of cumulus cells is reliable with the oocyte maturity, where metaphase II oocytes are associated to more cumulus cells than metaphase I oocytes. Additionally, we describe that oocytes which originate better quality embryos are those surrounded by more numerous cumulus cells that tend to present minor apoptosis incidence. Mature oocytes are enclosed by cumulus cells that present different levels of progesterone receptors expression, where genomic receptor nPR-A/B is expressed in more cumulus cells then the non-genomic PGRMC1. The establishment of a pregnancy seems to be related with a higher connexin 43 expression in cumulus cells