Morfogénese in vitro em tamarilho: análise dos processos de organogénese e embriogénese somática

Dissertação de mestrado em Biotecnologia Vegetal, apresentada ao Departamento Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.A embriogénese somática é um processo que permite a rápida propagação de espécies economicamente importantes e uma poderosa ferramenta na transformação genética. Uma das fases mais importantes neste processo é a maturação dos embriões somáticos, visto que durante esta fase é comum ocorrer um número significativo de embriões anómalos, o que pode ter implicações na sua conversão em plântulas. A indução da embriogénese somática e o desenvolvimento de embriões de tamarilho (Cyphomandra betacea) foram estudados no Laboratório de Biotecnologia da FCTUC e usados com sucesso na regeneração das plantas a partir de vários tipos de explantes. É um sistema de duas fases no qual a embriogénese somática é induzida em meio MS, na presença de uma auxina e com concentrações elevadas de sacarose, seguindo-se a transferência do tecido embriogénico obtido para um meio sem auxina e com níveis reduzidos de sacarose, de modo a obter embriões somáticos. Trabalhos anteriores demonstraram que optimizando as condições de maturação há um maior rendimento e uma melhor qualidade dos embriões formados. Neste trabalho, pretendeu-se optimizar a maturação de embriões somáticos de tamarilho, testando diferentes tipos de calos embriogénicos em diversas condições de maturação. Calos com diferentes idades, origens e qualidades embriogénicas foram avaliadas, variando a composição do meio de cultura, em particular pela adição de carvão activado, várias concentrações de sacarose e de outros agentes osmóticos para além da sacarose. A manifestação de diferentes capacidades embriogénicas por parte das linhas estudadas perante os tratamentos aplicados, confirmou assim a importância da origem e da idade dos explantes na obtenção de embriões somáticos maduros. O calo induzido a partir de material micropropagado de uma árvore adulta (TJ-CE3) revelou uma ausência de competência embriogénica, que poderá ser justificada pelos baixos níveis endógenos de peróxido de hidrogénio nesta linha de calo (cerca de 6 μmol/l), quando comparados aos detectados em calos embriogénicos (cerca de 12 μmol/l) induzidos na mesma altura, mas a partir de material com origem seminal (linha TV-CE2). De um modo geral, foi a linha TVCE1 a que demonstrou uma resposta melhor, em termos do número de embriões formados, sendo o ABA (2 mg/l, TMA2) o composto mais eficaz, neste tipo de calo, promovendo o desenvolvimento de 204 embriões/100 mg de calo. No caso do TV-CE2, uma linha de calo mais recentemente estabelecida, contrariamente ao esperado, este apresentou respostas inferiores ao TV-CE1, sendo os melhores resultados obtidos para o meio TM2 (50,3 xi embriões somáticos/100 mg de calo). O controlo da maturação e dos processos de conversão através da análise histológica permitiram observar os efeitos das condições de cultura no desenvolvimento dos embriões, em particular no padrão apical-basal e na organização de meristema apical. Observou-se que, mesmo em embriões anómalos o meristema apical se organizou de acordo com o padrão normal, sugerindo que este tipo de embriões, teria potencial para desenvolver de uma forma normal e atingir a conversão em plântulas. Para além dos ensaios de maturação realizados foram testados factores influentes na indução de embriogénese somática como o genótipo, a dimensão do explante e as condições do meio, mais concretamente a sua composição química. Nestes ensaios observaram-se disparidades nas taxas de indução observadas para os 3 genótipos testados e na quantidade de calo observado. Foi o genótipo de tamarilho vermelho que apresentou as taxas de indução mais altas, a rondar os 68% de explantes com tecido embriogénico. A fragmentação dos explantes foliares em secções com 3-10 mm revelou-se uma técnica eficaz, permitindo a formação de quantidades superiores de calo embriogénico. Os ensaios de indução de organogénese in vitro realizados, recorrendo a material vegetal estabelecido in vitro (linha TJ), proveniente de uma árvore adulta, demonstraram, à semelhança do que se observou na maturação de embriões somáticos, uma baixa capacidade organogénica desta linha, visto que das gemas isoladas apenas 13,3% geraram rebentos caulinaresSomatic embryogenesis is a process that allows the fast propagation of economical important species and a powerful tool in breeding and genetic transformation. One of the most critical phases in this process is the embryo maturation, because during this stage it is usual to find a significative number of anomalous embryos, what may have implications in their conversion in emblings. Somatic embryogenesis induction and somatic embryo development of the Solanaceous tamarillo tree (Cyphomandra betacea) have been studied at the Biotechnology Laboratoty of FCTUC, and successfully used on the regeneration of these plants from several types of explants. It is a two-step system in which somatic embryogenesis is induced in MS medium containing an auxin and high sucrose concentrations, and the embryogenic tissues obtained must be transferred to an auxin-free medium, with reduced sucrose levels, in order to obtain somatic embryos. Previous work has demonstrated that, by optimizing maturation conditions, a higher yield and a better quality of the formed embryos can be achieved. In this work, it was intended to optimize the maturation of somatic embryos of tamarilho by testing different types of embryogenic callus in different maturation conditions. Callus at different ages, embryogenic origin and quality were assessed by varying the composition of culture medium, in particular by addition of activated charcoal, various concentrations of sucrose and other osmotic agents other than sucrose. The expression of different capacities by the embryogenic lines studied before the treatments applied, thus confirming the importance of the origin and age of the explants to obtain mature somatic embryos. The callus induced from micropropagated material of a mature tree (TJ-CE3) revealed an absence of embryogenic competence, which can be explained by the endogenous low levels of hydrogen peroxide in this callus line (about 6 μmol / l), where compared to those detected in embryogenic callus (about 12 μmol / l) induced at the same time but from seminal material source (line TV-CE2). In general, it was line TV-CE1 that showed a better response in terms of the number of embryos formed being ABA (2 mg / l, TMA2) the most effective compound in this type of callus, promoting the development of 204 embryos/ 100 mg callus. In the case of line TV-CE2, a callus more recently established, contrary to expectations, it showed lower responses to TV-CE1, the best results being obtained for the middle TM2 (50.3 somatic embryos /100 mg callus). Control of the maturation and conversion processes by histological analysis allowed observe the effects of culture conditions on embryo xiii development, in particular in the apical-basal pattern and in the apical meristem organization. It was observed that, even in the abnormal embryos apical meristem is organized according to normal, suggesting that this type of embryos would have the potential to develop normally and achieve conversion to plantlets. In addition to the maturation tests performed were evaluated factors that influence the induction of somatic embryogenesis as the genotype, the size of the explant and the environment conditions, more specifically to their chemical composition. In these tests it was observed differences in the rate of induction observed for the 3 genotypes and the amount of callus observed. Red tamarilho genotype showed higher induction rates, hovering around 68% of explants with embryogenic tissue. Fragmentation of leaf explants into sections of 3-10 mm proved to be an effective technique, allowing the formation of higher amounts of embryogenic callus. The induction of organogenesis assays performed in vitro, using established plant material in vitro (TJ line) from a mature tree, shown, similar to that observed in the maturation of somatic embryos, low organogenic capacity of this line, since that of gems isolated only 13.3% generated stem shoot